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第四章 DNA克隆用载体 第一节 载体的功能及其特征 外源DNA片段要进入细胞(受体细胞)，并在其中进行复制与表达，必须有一个适当的运载工具将其带入细胞内并载着外源DNA一起进行复制与表达。这种运载工具称为载体(vector)。 一、载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体必须具备下列条件： ①在受体细胞中，载体可以独立地进行复制。（拷贝数越高越好） 所以，载体本身必须是一个复制单位，称复制子(replicon)，具有复制起点。而且插入外源DNA后不会影响载体本身复制的能力。 ②具有合适的选择性标记，易于鉴定、筛选。 也就是说，容易将带有外源DNA的重组体与不带外源DNA的载体区别开来。 ③易于引入受体细胞，具有对受体细胞的可转移性 。 在原核生物的DNA重组中常用的载体是质粒和噬菌体。酵母和动物病毒等常用作真核生物克隆的载体。 ④具有多种单一的酶切位点，便于基因工程操作。 由人工构建完成。 ⑤长度尽可能小，载装能力强，便于运载大的外源基因。 由人工方法去掉非必需序列。 按来源来分： 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体 第二节 质粒 质粒(Plasmids)是存在于细菌、真菌、放线菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA，ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。 一、质粒的大小 细菌质粒的分子量相差较大，一般在5～400kb之间。 常用质粒大小在2～10kb之间。 二、质粒的基本特性 （一）自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。 （二）不相容性 利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。 （三）可扩增性 质粒能自主地进行复制，这样它才能随着细菌细胞的分裂而稳定地遗传。 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。 松弛型复制：拷贝数高，一个细胞中可达上千个拷贝； 严谨型复制：拷贝数低，一个细胞中一般低于5个拷贝（1个－－几个）。 （四）可转移性 在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。 三、质粒的构建 （一） 质粒人工构建的方法 方法就是在天然质粒的基础上进行DNA重组，拼拼接接，以改变其性能。 （二） 质粒人工构建的目的 （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择； （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组； （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量； （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝； （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件； 四、质粒的分类： 人工构建的质粒根据其功能及用途分为 1.多拷贝质粒 2.测序质粒 3.整合质粒 4.穿梭质粒 5.表达质粒 6.探针质粒 7.细菌人工染色体质粒 质粒DNA的类型 1.多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。 实验室常用质粒均属于此。 2.测序质粒 PCR产物直接用于克隆测序的载体，称为T载体。 常用： pMD 18-T Vector pMD 18-T Simple Vector pMD 18-T Vector pMD 18-T Vector说明： pMD 18-T Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。它是由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 pMD 18-T Simple Vector说明： pMD 18-T S