DNA 重组的载体课件.ppt

4）穿梭质粒 a) 分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构及 相应选择标记基因， 因此能在两种不同种属的受体中复制并检测。 大肠杆菌---链酶素穿梭质粒，大肠杆菌---酵母菌穿梭质粒。 b) 克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载体 直接从一个受体菌转移至 另一个受体菌中复制并遗传。 5）探针质粒 a) 设计用来筛选克隆基因的表达调控元件， 如启动子，终止子。 b) 装有定量检测表达程度的报告基因， （抗生素的抗性基因） c) 缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因 d) 当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点， 报告基因才能表达。 e) 表达量的大小直接反应 被克隆基因的表达调控元件的强弱。 6）表达质粒 a) 在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的 启动 子，合适的核糖体结合位点（SD 序列）， 终止子结构。 使得克隆在合适位点上的任何外源基因 都可在受体细胞中,高效表达。 大肠杆菌常用启动子：Lac, Tac, Trp,和来自噬菌体 强启动子 PL, PR 。 它们 由大肠杆菌 RNA 聚合酶 识别 起始. 来自 T7 噬菌体的 T7 启动子。 必须由 T7 噬菌体来源 T7 RNA聚合酶 识别 起始转录。 d) 表达载体用 T7 启动子必须用能产生 T7 RNA 聚合酶的 受体菌株 JM109 , BL21(DE3)。 e) PSPORT 系列和 pSP 系列。 4. 实验室常用大肠杆菌载体 质粒 大小(Kb) 选择标记 克隆位点 功能 pBR322 4.36 Ap,Tc BamHI,PstI,EcoRI 克隆载体 ? pGEX 4.9 Ap,Lac PstI,MluI, EcoRV 次级克隆载体 Ap,Iac, NarV 酶解作标准分子量 ? pKK233-2 4.6 Ap,Tc SalI, BamHI, 表达型NcoI位点提供 PstI, NcoI ,EcoRI 翻译启始密码子 ? pSP72 2.6 Ap XhoI, PstI, BamHI 表达型,携有 - HidIII EcoRV 双向T7,Sp6启动子 ? pSPORT1 4.11 Ap, Lacopz EcoRI ,SalI, Pst 表达型携有 BamHI ,HidIII 双向T7,Sp6启动子 ? pUC18/19 2.69 Ap,Lacz EcoRI, HidIII 测序载体, KpnI ,BamHI 次级克隆载体 5. 质粒的纯化 1.? 碱裂解法 a) 溶菌酶 破细胞壁； b) SDS-NaOH 混合液 去细胞膜，释放细胞内含物 ； c) 高浓度 醋