第03章 蛋白质的通性、纯化与表征课件.ppt

蛋白质是一种两性电解质 蛋白质份子表面分布着不同的电荷。 蛋白质等电点：使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等时溶液的pH值为蛋白质的等电点（pI）。 蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。 3、蛋白质的分离纯化 蛋白质分离纯化的总目标：增加制品的纯度或比活性（单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性）。 蛋白质分子的大小：透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 蛋白质溶解度：盐析、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀 蛋白质电荷状况：凝胶电泳、等电聚焦、离子交换层析 蛋白质吸附性质：羟基磷灰石吸附层析、疏水作用层析 蛋白质生物学亲和性：亲和层析 透析：半透膜阻留pro分子，而让小的溶质分子（无机盐）和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸，单糖等）。 超滤：施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子。 分配系数Kd 可以把凝胶层析看成是液-液分配层析。固定相是凝胶珠内部水相（Vi），流动相是凝胶外部水相（Vo）。Kd为样品在两相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部水和外部水中的分配系数，它只与被分离物分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的粗细长短无关，也就是说它对特定物质为常数，与柱的物理条件无关。 Kd = (Ve-Vo)/Vi (3)当0Kd1时，内水体积只有一部分可被组分利用，能部分的扩散渗入内水中，Ve在Vo与Vo+Vi之间变化，即 Ve=Vo+KdVi (Ⅱ)。 (4)有时Kd1，表示凝胶对分子有吸附作用，此时VeVo+Vi，例如一些芳香族化合物苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在Sephadex G-25中的Kd值分别为1.2，1.4和2.2。 4）等电点沉淀 定义 利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法。 原理 当溶液pH值为蛋白质的等电点时，分子表面的净电荷为零，导致蛋白质表面双电层和水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。 特点 等电点沉淀法操作十分简单，试剂消耗少，给体系引入的外来物也少，是一种有效的蛋白质初级分离方法，尤其对疏水性较强的蛋白质。其主要优点在于很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价格低廉，因此可以省去除酸的步骤。 本章重点知识 蛋白质溶液的酸碱性和等电点的大小主要与什么有关？ 蛋白质胶体能保持稳定的主要原因。5种蛋白质沉淀方法的主要原理（主要破坏蛋白质胶体的那种稳定因素）。 凝胶过滤分离蛋白质的原理。蛋白分子量大小、分配系数和洗脱体积三者之间的关系。 等电点沉淀法、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）分离蛋白质的原理。 第03章 蛋白质的性质和分离纯化 Properties and Purification of Protein 生 物 化 学 Biochemistry 生命科学与技术学院 陈吉宝 1、蛋白质的酸碱性质 pH=6 蛋白质溶液处于等电点时，溶解度最小。 由于①蛋白质表面极性基团形成的水化膜，②非等电状态时，同种电荷的互相排斥，③质点大小在1-100nm，故蛋白质水溶液是胶体溶液。 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素①水化层(hydration shell);②静电排斥： 2、蛋白质的胶体性质与沉淀 一旦电荷被中和或水化膜被破坏，在蛋白质的疏水作用下，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。 蛋白质沉淀(precipitation)的方法 ③重金属盐沉淀法：pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子结成不溶性沉淀（Ca 2+、Mg 2＋、Ba 2+、Pb 2+与羧基结合；Mn 2＋、Zn 2＋、Fe 2+、Cu 2+、Co 2+、Ni 2+与羧基、含氮化合物及杂环化合物结合；Ag+、Hg 2+、Pb 2+能与巯基结合）。重金属沉淀的蛋白质常是变性的。 ②有机溶剂沉淀法：与蛋白质份子争夺水分子，破坏蛋白质表面的水化膜，降低介电常数。使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇等。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。 ①盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。蛋白质不变性。 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电点时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。酸?类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀：将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，热稳定性差的蛋白质将发