阳性克隆鉴定和质粒DNA的提取课件.pptVIP

实验五 阳性克隆鉴定和质粒DNA提取 【实验目的】 学习大肠杆菌转化阳性克隆的鉴定 学习碱法提取质粒DNA的方法和技术 【实验原理】 重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞后，还需要对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体（如pUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶α肽链氨基端（146个氨基酸）的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列（ω片段）的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质 。 这样，LacZ基因编码α肽链与失去N端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种互补现象叫α互补。由α互补而产生的Lac＋细菌易于识别，因为它们在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落，而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无α互补能力的氨基端片段，因此带重组质粒的细菌形成白色菌落。这一简单的颜色试验大大简化了在这种质粒载体中鉴定重组体的工作。 碱法提取质粒是基于细菌染色体DNA与质粒DNA的变性与复性特征而达到分离目的的。在pH高