两歧双歧杆菌固态培养的研究.doc

两歧双歧杆菌固态培养的研究 摘 要:两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) ATCC29521在含质量分数为20%惰性固态物质(纤维素)的MRS固态培养基中,若营养物的质量分数比液体培养基中营养物的质量分数提高1倍,则菌体生长量也相应提高1倍(达119@108cfu/g).经过3种固态基质作比较后,发现大豆渣和麦麸为佳,前者的含菌量最高达514@108cfu/g,后者含菌量最高可达213@108cfu/g.通过加入可中和所产酸量的CaCO3,并用缓冲液代替水配制培养基,结果发现用pH618的缓冲液配制培养基,培养后含菌量可达16@108cfu/g,比对照的液体培养提高了1114倍.通过/液-固先后培养0并测定其中活菌数的变化,进一步证明了固态培养的优越性. 关键词:两歧双歧杆菌;固态培养法;益生菌 双歧杆菌是国内外正在快速发展的微生态制剂(益生菌)中的主要菌种.在我国,尽管目前市场上利 用双歧杆菌制成的活菌制剂品种繁多、剂型多样,但普遍存在着活菌含量低、保质期短和/亿活菌价0过高 等缺点[1].因此,努力探索该菌的基本生长规律和高密度生长条件,就具有十分重要的实际和理论意义. 常规的双歧杆菌培养用的几乎都是液体培养法.可是在我们的研究中却发现,用液体培养基培养后, 不论是静止培养还是搅拌培养,其生长量总是很低.从液体培养的缺点出发,并参考了双歧杆菌在人体肠 道内固态环境下可以达到高约1010cfu/g的高密度生长的情况,我们提出了对双歧杆菌进行固态培养的 设想.在检索了国内外大量文献后,发现目前尚无采用此培养方法的报道.现将初步研究结果作一报道. 1 材料和方法 菌种:两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) ATCC29521;培养基:MRS培养基[2];固态基质:纤维 素(Cellulose SP-100, Serva Co.),麦麸,大豆渣,芋艿渣;厌氧培养装置:825-A型厌氧罐(沈阳人民医院生 产),亨盖特试管及丁基橡胶塞;仪器:METROHM 654 pH计(made by Metrohm Herisau Switzerland), CDE-280多功能食品搅拌器(顺德市科圣电器实业有限公司). 双歧杆菌的培养法:1菌种活化.取少量菌种接入装有9 mL液体MRS培养基的亨盖特试管中,然后 抽气、充氮,重复3次后,置于37e厌氧培养24 h.o固态培养.称取固态基质(纤维素、麦麸、大豆渣等) 放入10 mL小烧杯中,加MRS培养液,使固态基质和培养液的总重量为5 g,并且不论哪种基质,都使培 养基中营养成分的质量分数为514%,即0127 g.灭菌后,接入活化的菌液1 mL,放入厌氧罐中经抽气换 气后在37e下厌氧培养. 双歧杆菌计数用马-周试管计数法[4].大豆渣的制作:将新鲜的大豆用水浸泡24 h,然后用食品搅拌 器搅碎,挤去浆液.芋艿渣的制作:将新鲜的芋艿切成小块,然后用食品搅伴器搅碎,挤去汁液即成. *收稿日期: 1999-07-01 作者简介:王雪奇(1972)),女,硕士研究生;复旦大学微生物及微生物工程系,上海200433 基金项目:上海市高等学校科学技术发展基金资助项目(95A44)2 结 果 2.1 营养物质量分数的变化对双歧杆菌生长量的影响 在纤维素的质量分数为20%的固态培养基中,比较了不同质量分数的营养物(MRS培养基中的营养 成分)对ATCC29521生长量的影响,结果见图1.由图1看出,营养成分的质量分数相同的培养基中,固态 培养基比液态培养基获得的活菌数多.营养成分的质量分数为1018%的固态培养基获得的活菌数最多, 比营养成分的质量分数为514%的固态培养基活菌数高出1倍,比营养成分的质量分数为1612%的固态 图1 营养物含量不同的MRS纤维素培养基对ATCC29521生长的影响 Fig.1 Number of cfu/g of ATCC29521 in the cellulose solid medium with different concentration of nutrient 培养基高出近214倍. 2.2 合适固态基质的选择 分别以大豆渣、麦麸、芋艿渣和 纤维素为基质,以液体MRS培养基 为对照,进行培养.比较的结果见 图2.从图2可以看出,麦麸和大豆 渣是较好的基质.以大豆渣为基 质,活菌数达到了215@108cfu/g; 以麦麸为基质,活菌数达到了211@ 108cfu/g. 2.3 最适生长pH值的选择 从文献上得知,双歧杆菌的最 适生长pH值在610~710之间,pH 在515以下停止生长[5].事实上,在 培养的过程中,由于双歧杆菌产酸, 培养基的pH值一直在不断地降低. 图2 ATCC29521在以大豆渣、芋