人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究.docVIP

人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究 人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophi l elastase，HNE)在机体各种炎症反应、组织损伤重构（如肺炎）、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急（慢）性肺损伤、肺水肿、动脉粥样硬化、硬皮病等病理过程中起重要作用，并且具有促进病毒、细菌的侵人及癌细胞转移的功能。炎症机制研究显示，体内该酶及其内源性抑制剂的平衡失调可导致组织基质降解和炎症的恶化。目前，国外用HNE抑制剂来治疗这一类炎症疾病的研究非常广泛，并已成功开发出第一个以抑制HNE为治疗途径的上市药物西维来司钠（sivelestat sodium hydrate），从而促进了HNE抑制剂的研究与开发。 ????1　BM的生理、病理作用及结构特征 ????HNE，又称人白细胞弹性蛋白酶（human leukocyte elastase，IRE），属于基质金属蛋白酶类（matrix metalloproteinases,MMPs），即MMP-12,是一种金属离子依赖性基质降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+ 离子的存在才具有酶活性，其底物类型非常广泛，几乎可降解细胞外基质中的所有蛋白。白细胞、巨嗜细胞、肥大细胞内都存在着这种酶，中性粒细胞中其含量很高，大约每106个细胞中含有HNE的总量为 3μg。生理条件下，HNE可以协助清除异源性物质，促进吞噬细胞消除有害病菌，并帮助消化受损组织，有助于伤口的愈合与组织再生。而HNE过量表达则会对机体组织、基质造成危害，表现为破坏血管壁组分，使中性粒细胞更容易渗出血管并向炎症部位趋化集中及释放IL-8、TNF-α等炎症因子；它还能降解细胞基质，催化caspase 3诱导的细胞凋亡。据报道，HNE还能增强病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附能力，促进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。 ????HNE存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，是由 218个氨基酸组成的单一肽链，分子质量大约25.9 kD，含4个二硫键，是丝氨酸蛋白酶家族一员，因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具有30%～40％的同源性，最适pH值接近中性。HNE的基因位于19号染色体的短臂末端，是50kb的DNA片段，成熟的中性粒细胞中并无HNE的mRNA表达，说明此种酶只在未成熟的骨髓细胞中合成。酶的催化中心由 His 41、Asp 88和Ser 173三个氨基酸残基构成，空间位置相互靠近，均由发夹结构延伸到蛋白表面，其中 Ser残基侧链上羟基具有很高的亲核性，容易结合不带电的小分子氨基酸，如Val、Ala、Leu、Met等。 ????2　BM抑制剂 ????HNE对机体会产生各种病理作用，故关于其抑制剂的研究也受到广泛关注，其中包括内源性抑制剂、合成的外源性抑制剂（蛋白类、拟肽和杂环化合物）以及天然提取物等。 ????2.1　内源性抑制剂 ????人体内存在许多种针对HNE的快速反应抑制蛋白，每一种蛋白存在于不同的生理部位而发挥不同的作用。选择性HNE抑制剂Elafin存在于皮肤及上皮组织中，分子质量为7 kD，是酸稳定性多肤；α1- 抗蛋白酶（α1-antiprotease）在血浆中具高浓度，并由此进入组织发挥作用。上述内源性抑制剂包括α2- 巨球蛋白均为分泌性弹性蛋白酶抑制剂，其中 α1-抗蛋白酶被认为是在体内各种脏器中起主导作用的内源性HNE抑制剂。 ????2.1.1　α1-抗蛋白酶　它在许多生理、病理过程中（如血液凝结、纤维蛋白溶解、炎症等）起调节蛋白分解的作用，并且对防止蛋白水解性组织损伤起重要作用。据报道先天性α1-抗蛋白酶缺损极易引发肺气肿和自发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis）。 ????α1-抗蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，存在于血浆中，平均分子质量约50 kD，含有3 个β片层结构和若干α螺旋结构，其中Met 358决定了它对HNE的抑制特异性，HNE与之结合后形成稳定酯结构，致使酶的活性中心构象发生改变，不能去酞基化，这种抑制机制被称为自杀性底物抑制。对α1-抗蛋白酶的结构研究显示，它和其他HNE拮抗剂一样，在酶结合位点或附近的Met上的硫醚键对化学氧化非常敏感，一旦Met被亚砜化后，α1-抗蛋白酶即失活。 ????在体内氧化自由基的增多是造成这种内源性抑制剂失活的主要原因，中性粒细胞分泌出的髓过氧化物酶通过过氧化酶-过氧化氢-卤化物系统使α1_ 抗蛋白酶氧化失活，从而达到HNE活性增高，促进细胞渗透转移的目的。在体外试验中，中性粒细胞中的过氧化物系统可使α1-抗蛋白酶在10秒之内失活50%，20秒之内完全失活。 ????2.1.2　Elafin　它是一种被研究得比较深入的内源性抑制剂，又称为弹力素，属于Trappin-2基因家族。它在多种上皮组织中