幽门螺杆菌液体培养改良方法的研究.doc

幽门螺杆菌液体培养改良方法的研究 摘要：采用烛缸培养，模拟微需氧条件，通过单因子试验统计分析，探讨不同因素对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp )生长的影响，改良了适于幽门螺杆菌液体培养的方法。结果表明，在适宜的烛缸培养条件下，Hp能够在添加β-环状糊精的布氏肉汤中很好地生长。 关键词：幽门螺杆菌，液体培养，烛缸法 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp ) 已被证实是慢性胃炎及消化性溃疡的主要病因, 且与胃癌的发生密切相关。Hp培养是研究Hp的基本方法之一。传统方法都是采用固体培养，存在着环境要求高，所获菌量少，费时费力等诸多缺陷。为了深入研究Hp的致病机制，分析毒力相关蛋白，必须实现幽门螺杆菌的液体培养以获取大量Hp菌体，并为下一步开展Hp的蛋白质组学研究和疫苗学研究奠定基础。本实验通过对传统的烛缸法以及磁力搅拌加以改良创新进行摇菌液体培养，并筛选几种比较适合Hp液体培养的培养基，对其他几个可能影响培养效果的因素加以探索，动态测定OD600、菌体湿重和染色观察液体培养的产量和对Hp形态的影响。 1 材料与方法 1.1 菌种 幽门螺杆菌临床株T119、N76 均由我室从临床胃病患者的胃镜活检组织分离培养所得, 经染色、脲酶试验以及PCR 鉴定, 液氮保存。胃镜标本来自我校附属第一医院胃镜室。国际标准株NCTC11637，J99购自 1.2 培养液 基础培养液：（1）脑心浸液37mg/ml,（2）M ueller-H inton bro th (MHB )21mg/ml,以上两种试剂购自 公司，（3）布氏肉汤（配方） 。 以上培养液均加入抗生素混合物(100ml 含TMP 50mg ,万古霉素60mg ,多粘霉素B2500IU ,两性霉素20mg) 。 添加成分：β-环状糊精（0.2%），胎牛血清（ ） 1.3 仪器 GE Ultrospec 2100proUV/Visible Spectrophotometer紫外分光光度计、烛缸、 ml平板、IKA KS 260 BASIC摇床、Olympus生物显微镜、磁力搅拌器（品牌名） 1.4 培养方法 在平板中加入10ml培养液，接入相应浓度的菌液，将平板固定于烛缸中，在烛缸中放入几只点燃的蜡烛，用真空脂将烛缸密封，通过蜡烛耗氧燃烧使缸内气体环境达到适宜Hp生长的微需氧条件，将烛缸固定于摇床上，恒温37 ℃振荡培养。 1.5 检测方法 OD值测定：以同种培养条件下未加Hp的液体培养基作为空白对照，每隔4～6h取样 ml加入 ml相应培养液，在紫外分光光度计600nm波长下测定其吸光度值。 1.6 最适培养液选择 将107cfu/mLHp菌液 ml分别接种于10ml以下培养液中：布氏肉汤、布氏肉汤+β-环状糊精、布氏肉汤+胎牛血清（9：1）中、MHB、MHB+β-环状糊精、MHB+胎牛血清（9：1）、脑心浸液、脑心浸液+β-环状糊精、脑心浸液+胎牛血清（9：1）。转速100r/min, 37 ℃微需氧培养。每隔4～6h测定OD600，涂片革兰染色观察形态。 1.7 最适菌种选择 在相同条件下培养幽门螺杆菌临床株T119、N76，国际标准株NCTC11637，J99。分别加入到10ml布氏肉汤+胎牛血清培养液中，微需氧条件下37 ℃、100r/ min培养，每隔4～6h测定OD600 , 涂片革兰染色观察形态。 1.8 不同接种量对菌体产量的影响 分别将106 cfu/mL 、107 cfu/mL 、108cfu/mL和109cfu/mL 不同浓度的Hp 菌液各 mL种于10mL 培养液中,微需氧条件下37 ℃、100r/ min 振荡培养。每隔4～6h测定OD600 , 涂片革兰染色观察形态，确定Hp 菌株的最优接种浓度。 2 结果 2.1 最适培养液选择结果 结果见图1。 2.2 最适菌种选择结果 2.3 不同接种量对菌体产量的影响 3 讨论 幽门螺杆菌是一种营养要求很高的微需氧菌，一般培养条件下不能生长。目前，针对Hp的固体培养方法已经较成熟，但是，液体培养尤其是用于大规模培养的方法仍存在许多问题。传统的烛缸法一直作为简便易行的固体培养微需氧发生器，本实验将其改良以适合液体培养，并通过研究调整多种影响因素使之进一步优化，以建立一种适用于普通实验室开展的简便、易行、经济的液体培养方法。 本实验采用单因子试验统计分析技术，即固定其它条件逐个选择某个因子的最佳条件，最终选出每个因子的最佳条件组成最优培养液和培养条件。结果表明，在适宜的培养条件下，Hp能在添加胎牛血清的布氏肉汤中