第六节 单链内切核酸酶课件.pptVIP

第六节 单链内切核酸酶 小组成员：耿沙沙 赵彦朵朱新娅 王高伟 一、S1核酸酶 S1核酸酶来源于米曲霉菌，是一种含锌的蛋白质，相对分子质量为32000，相对耐热，由nucO编码，该基因已被克隆。S1核酸酶是一种高度单链特异性的内切核酸酶，催化反应需要Zn2+和酸性条件，最佳pH4.0~4.5。 * * * 基因工程 本节重点： 1.S1核酸酶的活性和应用。 2.Bal31核酸酶的活性和应用。 3.脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ)的活性和应用。 S1核酸酶的特性： （1）在高离子强度、pH4.2和1mmol/LZn2+存在的条件下，S1核酸酶可以高特异性地降解单链DNA和RNA，包括双链分子中的单链区域（如发卡结构），反应产物为5单核苷酸。 （2）调节S1核酸酶的用量，可以切割双链DNA的单链缺刻，但不能识别单个碱基 对的错配。 （3）当S1核酸酶用量过大时，伴有双链核酸的降解，但该酶降解单链DNA的速度是降解双链DNA的75000倍。 S1核酸酶的应用： （1）可用于切掉DNA片段的单链突出末端以产生平末端； （2）打开双链cDNA合成中的发夹环结构； （3）S1核酸酶作图法在测定杂交核酸分子的杂交程度、RNA分子定位、确定内含子的位置、内含子和外显子剪切位点的定位、转录起始位点与终止位点的测定中，S1核酸酶都是十分有效的工具。 S1核酸酶的活性可被PO43-、5核苷、核苷三磷酸、枸橼酸盐和EDTA抑制。然而，其在低溶度的变性剂（如SDS、尿素甲酰胺）存在的条件下稳定。 二、 Bal 31核酸酶 Bal 31核酸酶的特性： ?对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3-OH末端迅速降解DNA。 ?对于线性双链DNA分子，它表现为3→5端的外切酶活性和5→3的外切酶活性，可有控制地从3末端和5末端逐个水解除去单核苷酸，产生缩短了的DNA分子。（注意：Bal 31的3外切酶活性约为它的单链特异性内切酶活性的20倍） ?当底物是双链环形的DNA分子时，Bal 31的单链特异性内切核酸酶活性，通过对单链缺口或瞬时单链区的降解作用，将超螺旋的DNA切割成开环结构，进而成为线性双链DNA分子。 ?除此以外，Bal 31核酸酶还可起到核糖核酸酶的作用，催化核糖体和tRNA的降解，但它不具有双链特异的核酸外切酶活性。 Bal 31核酸酶的应用： Bal 31核酸酶降解DNA需要Ca2+的存在，在反应的不同阶段加入螯合剂—EGTA（乙二醇双β－氨基乙醚四乙酸）可使反应终止。 （1）用于确定DNA片段的限制酶图谱 使用Bal 31核酸酶降解待测DNA，在不同反应时间取出反应物，用EGTA溶液中止反应。然后，各样品用相应限制性内切核酸酶消化后，可看到酶切片段按一定的顺序消失。 限制酶图谱就是一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。它实际上就是限制酶的特异切点在DNA上的定位，表现出一些部位的线性序列，它是DNA分子结构特异性的反映，所以限制酶图谱又称DNA的物理图谱。 （2）可用于在克隆前通过可控方式去除双链DNA末端不需要的序列。处理后的DNA末端，可用T4噬菌体DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段补平，再加入合成接头，插入适当载体。用此方法，还可以在DNA上生成一系列终点确定的缺失突变体。 （3）用于确定DNA分子的二级结构 * * * *