5-基因工程与基因重组解答.ppt

IMAU, Huo XW 第五讲 基因重组与基因工程 Recombinant DNA Technique and Genetic Engineering DNA片段的连接 重组DNA分子构建的最后一步是连接，通过连接酶完成。相对而言，钝端的连接效率较低，因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会。而粘性末端的连接效率较高，因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对。这种暂时的、碱基配对结构可以提高连接的效率。在分子克隆的连接方式主要有以下几种： 一、连接方式（一）相同粘性末端的连接　　来源:　　　相同的酶　　　同尾酶　　问题:　　　极性有两种可能 　同尾酶连接后，不能用任何一种酶酶切。称为“焊死”。 （二）平头末端的连接　　粘性末端--分子内部连接，平头末端--分子间的连接。　　提高连接效率的方法： 　　加大酶用量（10倍） 　　加大平头末端底物的浓度　　加入10%PEG（8000），促进分子间的有效作用 　　加入单价阳离子， 150-200mM NaCl　　提高反应温度　　平头连接同样存在两种极性 （三）不同粘性末端的连接　　突出5末端　　Klenow补平，或S1核酸酶切平，然后平头连接　　突出3末端　　T4-DNApol切平，然后平头连接　　突出末端不同 　　Klenow补平，或S1核酸酶切平 　　连接后，可能恢复限制性位点，甚至还可能产生新的位点。XbaI与HindIII（ XbaI恢复）， XbaI与EcoRI（均保留），BamHI与Bgl II（产生ClaI位点） （四）人工粘性末端的连接　　5‘突出的末端  　外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。 　3’突出的末端 　 外源片段先用TdT加polyG；载体片段加polyC；然后退火；再用Klenow补齐；连接 　 平头末端可直接用TdT补加末端，但以加polyA/T为佳。这样稍微加热，AT区就会出现单链区域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段 （五）粘端与平端的连接　　linker : 人工合成的、含有限制性内切酶识别序列的、短的双链DNA片段。 – 连接的效率较高 – 酶切时可能破坏DNA分子的完整。　adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。 （六）粘性末端的更换　　在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口　　　– BamHI酶切片段用Klenow补平，或用S1酶切平；连接一段linker或Adaptor，使之产生EcoRI粘性末端。这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 。　　　– 由AluI更换EcoRI：AluI切开，T4-DNApol切平，另一段DNA EcoRI切开，Klenow补平，连接，原来含有AluI的片段变成含有EcoRI 二、重组率　　重组率：连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比。较为理想的重组率为25-75% 提高重组率的方法： 连接反应条件 外源片段：载体＝2:1-10:1（分子数），增加碰撞机会，减少自身环化。 载体除磷 （磷酸酯酶5’除磷）。 TdT在3’端增加人工粘性末端，防止载体自我环化 。 1. ?噬菌体(phage) ?噬菌体为线状双链DNA分子，长度约为49Kb，在?DNA分子的两端各有12个碱基的单链互补黏性末端，当?噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状的DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点(cohesive endsite)。 选用?噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 （1）?噬菌体是一种温和?噬菌体，对大肠杆菌具有很高的感染能力，容易保存，可进行大量增殖。 （2）能承载较大的外源DNA片断。野生型?噬菌体头部容许包装?DNA分子大小75％－105％的DNA片断，约36.4－51Kb，而且20Kb的区域对?噬菌体的生长是不需要的，可以缺失或被外源DNA片断取代。 （3）在?DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片断的克隆。 2. 粘粒(cosmid) 特征 （1）构建的cosmid克隆载体是一种环形双链DNA分子，其大小不超过36.4kb，一般在10kb以下。 （2）具有质粒的性质，可以承载外源DNA片断，转化大肠杆菌受体细胞，并在大肠杆菌细胞内复制和增殖。 （3）含有 cos位点，提供体外包装必需的cos末端。 （4）构建的cosmid克隆载体较小，但能承载比较大的外源DNA片断，约40kb左右的外源DNA片断。 感受态细胞(Competent cells):