实验三_酵母RNA的提取及含量测定.docVIP

酵母RNA的提取及含量测定 一、实验目的与要求 了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法； 了解测量核酸浓度不同方法的原理； 熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法； 熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 二、实验原理 1、RNA提取原理： 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。 酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。 2、测定RNA含量的方法： （1）紫外吸收法原理：核酸具有吸收紫外线的性质，在波长260纳米处有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收值与浓度成正比 （2）地衣酚显色法：核酸与浓盐酸共热，放生降解，生成糠醛，后者与地衣酚反应，在三价铁离子或二价铜离子作用下，生成鲜绿色的复合物，670纳米处有最大吸收，且光吸收值与浓度成正比，符合朗伯-比尔定律。 （3）定磷法：在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中无机磷酸生成磷钼酸，当有还原剂存在时，磷钼酸立即被还原生成蓝色的还原产物--钼蓝，其最大吸收在660纳米处，当无机磷含量在每毫升1-25微克范围内，光吸收与含磷量成正比。测量样品核酸的总磷量，需先将它用硫酸或高氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可计算出核酸含量。优点测量准确，缺点操作繁琐。 3、紫外吸收法测定RNA含量： 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。 核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化。RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量为9.5%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022-0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。 蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 三、主要仪器和试剂 干酵母粉、pH试纸、电子天平、分析天平、100ml烧杯、量筒、吸管、离心机（4000r/min）、95%乙醇、无水乙醇、酸性乙醇、0.2%NaOH溶液、紫外分光光度计、200ug/ml的标准核酸 四、实验步骤 —0.25克样品核酸，加2毫升0.2%氢氧化钠溶液和1毫升水溶解，调成糊状，再加入50毫升左右水溶解，边溶解边转移到100毫升烧杯中，用0.2%氢氧化钠调至中性，定容至100毫升，再取毫升定容至100毫升备用。（开始溶液呈乳白色， 6、制作标准曲线，测定样品 五、实验结果 1、实验数据： 管号 标准曲线 样品 0 1 2 3 4 5 6 7 8 标准核酸/ml 0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 不加 水/ml 10 9.2 8.4 7.6 6.8 6.0 0 0 0 样品/ml 不加 10 10 10 浓度ug/ml 0 8 16 24 32 40 吸光度 0 0.214 0.338 0.458 0.617 0.765 0.620 0.618 0.628 2