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原位杂交 原位杂交(in situ hybridization，ISH) 是将核酸分子杂交技术与组织化学或免疫组织化学技术结合起来，利用已知的核酸探针(probe)在组织细胞的原位显示某种特定基因的存在或其mRNA表达的技术。 基本原理: 待测核酸一般是DNA或mRNA. 探针的主要种类有： 探针的制作： 寡核苷酸探针：化学合成 双链DNA探针：聚合酶链反应（PCR）等。 单链DNA探针：PCR、化学合成或克隆载体M13. RNA探针：亚克隆技术： 探针的设计 基本原则是： G、C之和占碱基总数的50-60%。 探针两端的碱基不能是互补的 探针内部的互补碱基不能连续超过5个。 尽量避免连续出现4个或4个以上相同的碱基排列。 寡核苷酸探针的长度通常为20-40个碱基。 DNA探针的长度通常为80-200个碱基不等。 RNA探针的长度通常为200-300个碱基不等。 注意其特异性，不可与其他基因有较多的重复碱基排列。 1 atgaagaatc tttacatcgt ggctggattg tttgtaatgc tggtggccca 51 gactacagca aatacctaga cattgccaaa tttgagagcg gcatgctgaa aaagaacagt aaacttagtc ggtcaactac ttcgagacc accgttccaa gatttttaaa aaggaggaat aaacacgaga acacaggtat gcggtttgta 201 aaccagtaca cgaatgttta tcctatacag ctggatctat tgcccttacg 251 aaacatgctc ttaacttttg ctctttcgat gttaacctac gactatctag 301 ggataataag agagtcaaag ggtaaatgcc actgaagtta ctagtccaaa 351 agtgatttgc tgtgtaacca tcagataaaa acttctcgta attcaaagta 401 atgagcacaa aaatgagaga gttttatgac atacaaaggg attgtgtgaa 451 ctagcctcaa ccctgccatc cttccaggtc attgttccaa catggccctg 501 tggatgatgc tcctgcccct gctggccctg ctcgtcctct gggagcccaa 551 gcctgcccag aacagcacct cacctggtgg aggctctgat cctggtgtgt 601 gggactaact ggcataatcg cccaatgcta ………. ………. 探针标记物的种类： 放射性的标记物 同位素（如35S,　32P） 非放射性标记物 地高辛（digoxigenin, Dig） 生物素（biotin） 酶（如HRP、碱性磷酸酶） 荧光素 磺基（如光敏DNP） *以Dig最常用。 原位杂交的程序 组织的固定： 目的：保持组织细胞的原有结构, 保持细胞内核酸的位置与水平 　 多采用4%的多聚甲醛缓冲液 直接固定（适合5mm3以下的小组织块） 灌流固定 冰冻切片后固定 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 （pH7.4）  Na2HPO4?12H2O 29.01ｇ NaH2PO4?2H2O 　2.96ｇ 焦碳酸二乙酯处理水(DEPC水) 　800ｍｌ 多聚甲醛 40g 搅拌加热至溶解 （65OC—70OC） 追加 DEPC水至　　　　　　　　 　1000ｍｌ 焦碳酸二乙酯处理水(DEPC水) 的配制 蒸馏水 1000ml DEPC 1ml 充分搅拌后静置数小时 高压灭菌(DEPC 乙醇+CO2) DEPC可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂 有致癌作用,使用时应注意。 切片时注意事项： 环境及器具的清洁 手套、口罩 DEPC水 干热灭菌 清洁玻片、涂粘附剂 杂交前处理： *使