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本章内容 大肠杆菌表达系统； 真核表达系统； 表达产物的分离纯化策略； 蛋白质标签技术； 多肽链拼接技术在分离纯化表达产物中的应用； 表达产物的分离与鉴定 DNA重组技术用于表达蛋白产物 DNA重组技术的重要应用之一即是用于在细胞中过表达某种蛋白，以方便地获得大量该种蛋白； 可以进行蛋白结构与功能研究； 或者是作为一种有用成分，为人们服务； 表达外源基因的总的要求 将外源基因置于强启动子的调控之下； 最好是诱导表达； 要保证产物稳定(不被降解)； 要保证便于分离、纯化； 要保证产物能获得正确的高级结构和活性(正确折叠)； 表达载体最能体现外源基因表达技巧 表达载体应当具有克隆载体的要求：有复制起点、有筛选标记、有合适的MCS等； 还应当有驱动外源基因的合适的启动子、转录终止子（如细菌rrnB rRNA操纵子的T1T2串联转录终止子等 ）以及必要的转录或翻译增强元件等； 1、大肠杆菌表达系统 优点：菌体繁殖快，培养基便宜，其基因表达系统研究透彻，外源蛋白表达量高，因此是重组蛋白生产的首选体系； 缺点1：没有RNA转录后拼接系统，不能进行翻译后修饰(糖基化、甲基化和磷酸化等)，并且容易在胞内形成包含体； 缺点2：含有对人有害的大肠杆菌内毒素，在制备重组药物时，必须设法从纯化表达产物中去除。 启动子强度、载体性质、翻译起始区RNA的二级结构、密码子偏爱性、mRNA稳定性和表达产物的稳定性(N末端规则)等； 启动子：选择强启动子； 核糖体结合位点：SD序列与16S rRNA 3‘末端互补程度；AUG 与SD 序列间的距离； mRNA二级结构及其稳定性。 大肠杆菌表达系统的启动子 能与RNA聚合酶结合起始以转录的一段DNA序列； 具有保守的元件：-10序列，-35序列； 另外还有一些与反式因子结合的特殊序列，对基因转录进行激活或抑制，以实现基因调控； 常用的细菌启动子 PLac：取自大肠杆菌Lac操纵子，受Lac 阻遏蛋白负控，受IPTG的诱导； PTrp：取自大肠杆菌Trp操纵子； PTac：Lac 启动子和Trp 启动子的杂合启动子； PL 和PR 启动子：来自噬菌体的强启动子，受λ噬菌体cI 基因负调控，温度诱导； T7启动子及表达系统； 取自大肠杆菌Lac操纵子，受阻遏蛋白Lac I负调控； 特点：受IPTG的诱导，在诱导表达时不能用葡萄糖作碳源物质（CAP的作用）； 缺点：驱动表达能力不高，且在无诱导时也存在少量表达； 后一问题可以通过对阻遏蛋白的编码基因进行改造得到改善（如lac Iq突变体lac I表达被提高，因而增强了无诱导时对启动子的抑制）； B Tac启动子(The tac Promoter,PTac) Lac启动子与Trp启动子进行“杂合”得到的启动子； 将PLac的-35(TTTACA)序列换成PTrp -35(TTGACA); 综合了Lac与Trp启动子的优点：能被IPTG诱导并且转录起始效率大约提高到5倍，使表达蛋白的量占到细菌总蛋白的20-30%; 而且：Ptac不受CAP的影响（葡萄糖不会抑制诱导）； C Theλ PL Promoter：PL 原来是位于λ噬菌体基因组上的左侧启动子，其阻遏蛋白为cI基因编码的蛋白； cI的突变型cIts857在30℃时可以阻遏启动子，在42 ℃阻遏作用解除； 因此借助于该启动子及阻遏蛋白可以实现外源基因的温度诱导表达； 优点：热诱导不用添加外来的诱导物，成本低；缺点：但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定。 D T7表达系统 利用T7噬菌体的RNA聚合酶来驱动外源基因的转录； T7噬菌体的RNA聚合酶（T7噬菌体1基因编码）为一条多肽链（与大肠杆菌RNA聚合酶α2ββ’σ不一样）； 表达宿主菌基因组有Plac启动下的1基因，表达载体有Plac启动下目的基因，并且还有一个表达T7溶菌酶的辅助表达载体； 典型例子：Novagen公司的pET表达系统； Novagen公司的pET的特点 目标基因被克隆到不为大肠杆菌 RNA 聚合酶识别的 T7 启动子之下，因此无 T7 RNA 聚合酶期间没有表达发生(关闭完全)； 重组质粒转移到基因组内有由 lacUV5 控制的 T7 RNA 聚合酶基因的表达宿主中，如果加入 IPTG 诱导表达可提供 T7 RNA 聚合酶，T7 RNA 聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达；诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的 50% ； pET其他特征 提供各种不同融合标签和表达系统配置 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌； 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物