分子生物学第四章课件.pptVIP

第四章 分子生物学的研究方法 一、重组DNA技术 理论上三大发现 技术上三大发明 * 遗传物质是DNA DNA双螺旋结构 遗传信息传递方式 工具酶 载体 转录酶 1973年 以DNA重组实验成功为标志 现代分子生物学 跨越天然物种屏障 定向创造新物种 工具酶 基因 载体 受体细胞 必要条件 操作过程 获得外源基因（目的基因/目的片段） 与载体进行体外重组形成重组体（重组子） 将重组体导入（转化/转导/转染）受体细胞 细胞扩增和筛选含有重组体的受体细胞（宿主细胞/寄主细胞） 培养含有重组体的细胞（阳性克隆）检测表达产物 分、 切、 接、 转、 筛 + 检 工具酶 限制性内切酶 连接酶 修饰酶 DNA聚合酶 DNA Polymerase 逆转录酶 Reverse Transcriptase T4多核苷酸酶 T4 Polymerase Kinase 碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase 活性定义 限制酶的一个活性单位（1U），原则上是在50μl的反应液中，37℃的温度条件下，经过1小时反应，将1μgDNA完全分解所需要的酶量。 特点 ① 识别部位序列一般为4、5或6个核苷酸序列； ② 呈双重轴对称。 限制性内切酶 性质 切断识别部位或其附近特定部位后，产生两种末端，即平齐末端和粘性末端（5’突出端和3’突出端）。 Pst I CTGC↓AG GA↑CGTC EcoR I 3’突出 5’突出 特殊的限制酶 同裂酶isoschizomer 指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。 同尾酶isocaudamer 指识别序列不同，但切割DNA后可以产生相同粘端的限制性内切酶。 DNA连接酶可以催化单链DNA的连接吗？ DNA连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？ 连接酶 主要连接酶的功能特点 最常用连接酶 T4DNA lingase E.coli.DNA lingase 平齐末端双链DNA分子的连接功能 有 无 匹配粘性末端双链DNA分子的连接功能 有 有 辅助因子 ATP NAD+ 载体和插入片段具有相同的粘性末端 容易连接成环状的重组DNA分子 可能出现问题： 载体自身环化，造成假阳性背景克隆； 插入片段可双向插入； 插入片段可多拷贝插入。 当DNA片段两端为非同源的粘性末端 可实现定向克隆，连接效率高，简捷 粘性末端连接 可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA?5’端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接； 利用磷酸酶防止载体DNA的重新环化 。 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 质粒载体的定向克隆 降解DNA，在双链DNA上产生随机缺口 DNA端酶I 降解除RNA RNA酶A 切除核酸末端磷酸基 磷酸酶 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出段变为平端 S1核酸酶、绿豆核酸酶 在3’ 末端加入同质多聚物尾 末端转移酶 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 T4多核苷酸激酶 合成cDNA第一条链 逆转录酶 聚合酶链式反应（PCR） Taq DNA聚合酶 连接两个DNA分子或片断 DNA连接酶 1、切口平移制作标记DNA探针；2、合成cDNA第二条链；3、填补双链DNA3’凹端；4、DNA序列分析 DNA聚合酶I或大片段Klenow fragment 识别DNA特定序列，切割DNA链 限制性内切酶 作 用 基因工程常用工具酶 E.coli. DNA聚合酶I E.coli. DNA聚合酶I大片段 （Klenow fragment） T4噬菌体DNA聚合酶 T7噬菌体DNA聚合酶 耐高温DNA聚合酶： Taq DNA聚合酶 DNA Polymerase Reverse Transcriptase Alkalinephosphatase T4 Polymerase Kinase 细菌碱性磷酸酶BAP 牛小肠碱性磷酸酶CIP 修饰酶 *