荧光定量实验方法操作手册.doc

Stratagene定量PCR仪标准曲线制作方法 定量PCR定量的基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释的样品作出标准曲线，未知样品和标准曲线相比较从而得到未知样品的量。无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物检测应用中都有可能要做标准曲线，分别用于绝对定量和相对定量。 标准样品的准备 1、绝对定量。绝对定量就是要确定未知样品的拷贝数。对于这类实验标准品是通过某种方法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列。最常见的是插入有目标序列的质粒，因为质粒是环状DNA有较强的稳定性，而且分子量比较大定量的时候比较准确。也有用线状的PCR产物作为标准品的，通常要比扩增的目标片段要大一些，这也是为了获得分子量比较大的片段，提高拷贝数的准确性。标准品的拷贝数是通过紫外定量的方法来确定，先得到标准品的浓度C(ng/uL)，因为无论是质粒还是PCR产物它们的序列都是已知的，这样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量B，则标准品的拷贝数A(copy/uL) 为： A=C/B×6.02E+14 2、相对定量。主要是针对基因表达分析实验而来的，因为要知道都是相对的数值（对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。 实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量，当然在基因表达分析中也不需要，而是要求根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如可以把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和稀释的倍数应该是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。 如何做标准曲线 在定量实验中标准品是要和未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品还是未知样品都将跑出曲线，获得了Ct值。那么先可以把未知样品放到一边，对于标准品来说，既获得了Ct值，还知道他们的拷贝数（虽然对于相对定量来说这个拷贝数是我们自己赋予的）。这样可以通过标准品的Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品的Ct值知道（通过实验求得的），这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。 事实上，操作起来没有那么复杂，只需要告诉软件哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来了。 举例来说如何进行设置 1、先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上unknow或standard等信息。 2、选择要使用的荧光染料。 3、设置复孔。 如果有些孔有重复就用用样的数字标明，这样仪器就知道哪些是重复，最终结果处理的话也可以取平均等操作。 有相同标号的系统就认为是同样的样品的重复。 4、标准品赋值 接下来要给标准品赋上值，系统要知道按照什么去计算 标准品赋值要先选上要赋值的标准品，然后在工具面板中输入相应的值。 为了方便设置系统有一个自动增加稀释倍数的设置，点开后就可以选择你的稀释倍数，然后用鼠标去选择孔的时候会自动增加 选择稀释倍数 每次选择不同的孔，在里面赋的值会自动按照倍数增加 5、设置温度 在这里提供一个对于SYBR染料常用的温度的控制模板，可以参考。注意最后的溶解曲线制作过程在升温的过程中选择标有all的放大镜，代表从55℃到95℃逐渐升温的过程中不停的检测荧光信号。 6、设好了之后可以运行程序了，最后的标准曲线和扩增曲线系统会自动给出，也会算出未知样品的拷贝数。 Stratagene荧光定量PCR仪基因表达分析解决方案 Stratagene荧光定量PCR仪和配套的Mxpro软件在处理基因表达分析方面的功能比较强大，下面简要说明如何使用该软件来进行基因表达分析。 例如要分析IL1基因的表达情况，用看家基因GAPDH作为内参，采用的是SYBR GreenI染料法。 1、板设置 1.1、专门的基因表达分析实验模式。打开Mxpro程序操作窗口，首先弹出的对话框是要用户选择要进行的实验类型，做基因表达分析可以选择第二项Comparative Quantitation (Calibrator)。 1.2、方便的类型选择和孔设定。在板设置中选择