人胚胎干细胞生物学特征及成骨诱导分化相关研究.docVIP

人胚胎干细胞生物学特征及成骨诱导分化相关研究 　　【摘 要】目的：研究体外培养人胚胎干细胞的生物学特征，初步探讨人胚胎干细胞向成骨细胞定向分化的特性，为后续成骨细胞移植治疗研究提供很好的资源。方法：体外传代培养人胚胎干细胞，显微镜观察细胞的贴壁生长情况，细胞染色体检查确认核型，免疫荧光染色检测人胚胎干细胞的异性和细胞周期，进行成骨诱导分化及碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定。结果：人胚胎干细胞在体外培养体系中增殖迅速，核型检测为46，XX，免疫荧光染色检测细胞表达人胚胎干细胞特异性标志，细胞周期检测结果显示细胞的增殖能力强，大部分细胞处于 G1期。人胚胎干细胞经成骨诱导分化后，碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性。结论：在特殊培养条件下，人胚胎干细胞在体外能维持其多能特性，体外可以诱导分化成为骨细胞，有望促进应用于骨组织工程移植治疗的机制探讨。 　　【关键词】人胚胎干细胞；生物学特性；成骨诱导分化 　　【中图分类号】R329 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0059-03 　　人胚胎干细胞（human embryonic stem cell， hESC）由内细胞团（inner cell mass， ICM）分离培养而得，其在体外能保持多能特性和向各个胚层细胞分化的潜能[1]，并能诱导分化为特定方向的细胞和组织，这在基因治疗、组织工程学、药学研究等众多领域具有广泛的应用价值[2]。在hESC的建系过程中，研究人员不断寻找分离获取各种ES细胞的最佳时期；探讨ES细胞的高效增殖和有效抑制其分化，但是在这过程中很容易出现非整倍体核型。目前很多研究利用工程化组织进行骨缺损治疗，将分离获得的间充质干细胞在体外用特定的培养条件在体外扩增，接种到三维构建的支架材料中，进行成骨分化诱导后填充到病人损坏处以达到促进组织修复及再生的目的。本研究通过在体外培养hESC，建立一套稳定的hESC培养体系，并对其生物学特性进行初步研究，为后续研究组织修复及再生提供和良好的基础条件。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料和主要仪器试剂 　　1.1.1 标本来源：样本由南方医科大学提供。 　　1.1.2 主要试剂：knockout-Dulbecco （DMEM），FBS（胎牛血清），beta-mercaptoethanol（β-巯基乙醇），β-磷酸甘油酯，Glutamax（谷氨酰胺），Non?essential amino acids（NEAA），0.25%Trypsin/EDTA（胰酶），维生素C，Pen/Strep（双抗），地塞米松，购自美国Invitrogen Gibco公司 ；碱性磷酸酶染色液（BCIP/NBT）购自武汉博士德生物工程有限公司，茜素红S试剂盒（GENMED）。 　　1.1.3 主要仪器和设备：超净工作台、二氧化碳培养箱（Forma）、体视镜（Nikon）、离心机（德国）、恒温水浴锅、冰箱（海尔）、移液枪（Eppendorf，德国）、培养皿（corning）、EP管、锥形离心管（corning），流式细胞仪（BD），荧光共聚焦（Nikon）。 　　2 方法 　　2.1 人胚胎干细胞（hESC）传代 　　用Dispase（1mg/ml）消化5-10分钟后传代，每天半量换液， 4-5天进行传代一次。 hESC培养液配方：在knockout-Dulbecco （DMEM） 中添加20% 血清替代物，0.1mmol/L非必需氨基酸，0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇，2 mmol/L谷氨酰胺，100 units/ml Pen/Strep（双抗），5ng/ml bFGF和2000 U/ml hLIF（以上均购自美国Gibco公司）。 　　2.2 人胚胎干细胞特征鉴定 　　2.2.1 碱性磷酸酶（AP）染色：去除hESC液，用PBS洗2遍； 4%多聚甲醛固定10分钟；PBS液洗2遍；加入碱性磷酸酶孵育液（博士德），避光孵育30分钟；PBS液洗2遍，光镜下观察结果。 　　2.2.2 免疫组织化学检测：去除hESC液，PBS洗2遍；4%多聚甲醛固定30分钟；PBS冲洗3遍，每次5分钟；0.1%TritonX-100/PBS通透10分钟；加入4%山羊血清室温孵育1小时；滴加一抗SSEA-3SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、OCT4（ 以上均购自Abcam） （PBS液1：100稀释）4度过夜；PBS冲洗3遍，每次5分钟；加入荧二抗光标记（FITC） （Invitrogen）4度过夜；PBS冲洗3遍，每次5分钟；DAPI进行核染色1小时；PBS覆盖后观察结果。 　　2.2.3 染色体核型分析：hESCs消化传代后第二天，0.25mg/l秋水仙素作用4小时，0.25% 胰蛋白酶消化细