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常用标本制备技术 一、常用光镜标本制备技术 1.切片标本的制备：常用的切片方法为石蜡切片，其制备程序如下：??⑴取材 从动物身体割取所需的新鲜组织一小块（厚度约0.5厘米）。手术愈快愈好，以防组织的死后变化。??⑵固定 把切取的小块组织，迅速投入预先配好的固定液[如10%福尔马林、0.5%锇酸、包氏液、岑克氏液、卡氏等固定液]中固定，使组织细胞的蛋白质变性，组织块硬化，以保存组织细胞原有的形态。??⑶冲洗（洗涤） 组织块自固定液取出后，须经流水冲洗或乙醇洗涤，使组织中含有的固定液全部除去，直至洗净为止。??⑷脱水 脱水的目的在于除去组织中的水分。因为组织中的水分和石蜡是不相溶的，为不使组织块在脱水时产生收缩，所以一定要经过各级浓度的脱水剂（如乙醇等）将水分脱净。??⑸透明 组织块脱水后，须经既可和乙醇相混，亦可作石蜡溶剂的透明剂（如二甲苯）透明，使组织中的乙醇被透明剂所替代，才能浸蜡包埋。??⑹浸蜡 浸蜡是将包埋剂（石蜡）透入整个组织的过程。石蜡透入组织需要一定的温度（石蜡熔点）。所以浸蜡都在恒温箱中进行。??⑺包埋 制备一定形状的容器（如纸盒等），倒入熔化的石蜡，迅速夹取浸透石蜡的组织块放入盒内，待表面石蜡凝固后立即将容器投入水中，使它凝固成蜡块。??⑻切片 组织块经上述处理后，不仅变硬，且有石蜡支撑，可用切片机将包埋组织的蜡块切成薄片，一般厚度是5～8微米。??⑼贴片 把由切片机切下的蜡条，分割成小段，分别排放于滴有蒸馏水的载玻片上，在展片台上微热，使皱褶的蜡片伸展平正。??⑽烘片 把贴有蜡片的载玻片置于45℃恒温箱中，烘烤3～4小时，使切片干燥。??⑾脱蜡与复水 组织切片的脱蜡等过程是在染色缸中进行的，因此须预先准备洁净的染色缸，并分别放入二甲苯、各级浓度的乙醇及染料溶液，按顺序贴好标签。染色前须先进行脱蜡和复水，即用二甲苯溶去切片上的石蜡后再经各级浓度乙醇（自高浓度到低浓度）下行到水的过程。因为没有经过复水处理的切片不能用水溶性染料染色，所以在染色前必须再度复水。脱蜡与复水的步骤如下：切片浸入二甲苯3～10分钟→二甲苯+纯乙醇（1：1）→纯乙醇→95%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→50%乙醇（以上每级乙醇停留的时间约2～5分钟）→蒸馏水2分钟。??⑿染色 切片染色以后可增加组织细胞结构的对比度。常用的生物染料是苏木素和伊红，简称H.E.染色。苏木素是一种碱性染料，经苏木素染色的结构呈蓝紫色（如细胞核）。组织中可被碱性染料着色的结构称嗜碱性。伊红是一种酸性染料，被伊红染色的结构呈红色或粉红色（如细胞质）。可被酸性染料着色的结构称嗜酸性。H.E.染色的程序如下：将已浸入水中的切片取出放入苏木素染液5～10分钟→自来水洗2分钟→0.5%盐酸水分色数秒种（在显微镜下检查核褪至浅红色，细胞质及结缔组织近无色）→蒸馏水1分钟→0.1%氨水（蓝化）1分钟→自来水冲洗5～10分钟→蒸馏水1分钟→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇（以上每级乙醇停留的时间约2～5分钟）→0.5%伊红（95%乙醇溶液）2～5分钟→95%乙醇分色（在显微镜下检查核呈蓝紫色，细胞质及结缔组织呈粉红色）→95%乙醇轻洗（洗净玻片上剩余的伊红染液）。??⒀脱水 已染色的组织切片，为了长久保存，又须再经各级浓度的乙醇脱水。即将上述已被染色的组织切片依次放入95%乙醇1分钟→纯乙醇（I）1分钟→纯乙醇（Ⅱ）2～5分钟。??⒁透明 透明的目的是除去组织切片中的乙醇，因组织中的乙醇不与树胶相溶，所以必须用透明剂除去乙醇后才能封藏。即将上述已脱水的组织切片依次放入二甲苯+纯乙醇（1：1）2～5分钟→二甲苯（I）2～5分钟→二甲苯（Ⅱ）2～5分钟。??⒂封固 在切片上滴加中性树胶，用盖玻片进行封固，保存备用。机体内有些结构成分，需经硝酸银处理（镀银或银染）时可使硝酸银还原，形成银的微粒附着在组织结构上，呈棕黑色，称这种性质为亲银性。有些组织结构本身不能使硝酸银还原，需加还原剂使硝酸银还原，称此为嗜银性。此外，为了显示某些特殊结构成分，还可应用各种特殊染色方法，如雷锁辛品红染色液显示弹性纤维等。??在制作较硬组织（如骨组织等）或较大组织器官（如眼球）等切片，为了减轻因石蜡包埋所产生的收缩，可用火棉胶（celloidin）代替石蜡进行浸透包埋，再进行切片染色。为了较好地保存细胞内的酶活性，可选用冷冻切片。它是将组织在低温条件下快速冻结，直接切片，进行染色。2、涂片、铺片、磨片标本的制备：血液等液体材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再进行固定和染色。疏松结缔组织和肠系膜等薄层组织，可在玻片上撕开展平，制成铺片，待干燥后进行固定和染色。骨和牙等坚硬组织除用酸（如稀硝酸等）脱钙后再按常规制成切片处，还可直接研磨成薄的磨片进行染色观察。二、