第七章_蛋白质分分离纯化和表征09.ppt

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 浓缩胶 样品 分离胶 在PAGE中，除了一般的电荷效应外，还有凝胶对样品的分子筛效应和浓缩效应， 三种效应共同起作用， 使样品的分离效果大大提高。 Tris-Gly pH=8.3 Tris-Gly pH=8.3 Tris-HCl pH=6.8 T=3% Tris-HCl pH=8.9 T=7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS） 0.5 1.0 kD 330 220 67 60 36 18.5 kD 94 67 43 30 20.1 14.4 Mol mass kD 300 200 100 80 60 50 40 30 20 10 Migration (Rf) Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis A stable pH gradient is established in the gel after application of an electric field. Protein solution is added and electric field is reapplied. After staining, proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values. 等电聚焦 (IEF) pH梯度制作：利用两性电解质(商品名: Ampholine)，多氨基多羧酸系列两性化合物同系物的复杂混合物，它们有相近但不同的pH和pI值，在电场作用下，自然形成pH梯度. 电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。 First dimension Isoelectric focusing Isoelectric focusing gel is placed on SDS polyacrylamide gel. Second dimension SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 双向电泳 (Two-dimensional electrophoresis) 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。 若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。 物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。 离子交换层析 阳离子交换剂： CM-纤维素：-O-CH2COOH P-纤维素：磷酸基 阴离子交换剂： DEAE-纤维素：二乙基氨基乙基 AE-纤维素：氨基乙基 亲和层析 　　　利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的 。 抗原和抗体 激素和受体蛋白 凝集素和糖蛋白 配体 蛋白质 蛋白质和配体复合物 交联试剂 载体 配体 载体与配体交联体 杂质 杂质 游离配体 六、蛋白质的含量测定与纯度 测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。 （一）蛋白质的含量测定 1. 双缩脲法 双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具两个以上肽键的物质均会发生双缩脲反应。 在碱性溶液中蛋白质可以与Gu2＋形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。 2. 福林－酚法 福林－酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜形成复合物，此复合物以及芳香族氛基酸残基可以还原酚试剂而产生蓝色，再与标准蛋白质(通常采用牛血清白蛋内)比色定量。 福林—酚试剂法灵敏度高，但是如果样品和标准蛋白质的芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差。 3. 紫外吸收法 　蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨