免疫组化设计一个成功的IHCICC实验..docxVIP

设计一个成功的IHC/ICC实验IHC实验方案，难题解决 上海优宁维生物科技有限公司?R D Systems位于细胞生物学行业领先地位，2009年NATURE系列刊物就有790篇论文使用RD Systems的产品。高质量的IHC抗体不仅提供低背景高信号的染色结果，而且可以反映组织生理学的真实结果。R D Systems抗体交叉反应低，特异性高，保证了真实可靠的信号结果。1. RD Systems一抗的质量如何？?为保障实验结果的可靠性，使用低交叉反应的高品质抗体。RD抗体主要采用活性重组蛋白作为免疫原，而不是人工合成的多肽。IHC/ICC抗体经过实验多重筛选及不同组织测试，避免了由于抗体的品质问题而导致的科研人员时间与样本的浪费，保证了真实可靠的信号结果。2. RD Systems一抗IHC应用区分石蜡和冰冻切片吗？区分IHC和ICC吗？?R D Systems抗体经过不同的细胞及组织材料的筛选，能特异性识别石蜡和冰冻切片中的抗原，IHC和ICC相互通用。3.做IHC/ICC, 选择单抗还是多抗？?单抗和多抗的固有特性决定了其优劣势。单抗，由单个B细胞克隆产生的，具有高亲和力和针对单个抗原表位的特异性。如需检测具有相同氨基酸序列的蛋白家族，单抗就非常适合。单抗和抗原结合的效果取决于抗原能否保持其天然构象。但是抗原的构象一旦由于各种原因发生改变，如由于蛋白相互作用，翻译后修饰，温度，pH，固定，盐浓度等，单抗和抗原结合的效果会受到严重影响。?由于多抗可以识别多个表位，不太受蛋白质构象变化的影响。一般来说，在一定的pH值和盐浓度范围内，多抗也比单抗更加稳定。基于这些原因，多抗比单抗更适合IHC/ICC实验。与其他公司多抗不同，R D Systems有一类经抗原亲和纯化的多抗（货号以AF开头），该多抗通过抗原亲和柱的纯化提高了特异性，更加适合IHC/ICC实验。4.一抗试剂的孵育条件？一抗浓度，温度，时间？?一抗抗体浓度，稀释，孵育时间和温度都会影响染色质量。这些变量需要针对不同抗体和样品进行优化，以达到高特异性，低背景的信号。一般的优化过程是，保持固定的孵育时间和温度，同时改变抗体的浓度以决定最佳的低噪音背景的信号。例如，使用一只高亲特异性抗体，可以使用相对较高的抗体浓度配套较短的孵育时间；或者，相对较低的抗体浓度配套较长的孵育时间。为促进特异性染色，常选用较长的孵育时间及较低温度下进行（如室温和4°C）。?R＆D Systems的染色优化方案: 对于组织切片，起始优化条件是4°C孵育过夜; 对于染色细胞，起始优化条件是室温孵育1小时。经抗原亲和纯化的多抗 (1.7-15 ug/mL) 较单抗(5-25 ug/mL)的工作液浓度低。如使用不同浓度的同一抗体比较样本的染色效果，孵育时间和温度一定要一致。在实验室中使用新抗体时，建议进行预实验测试教广的抗体浓度。一抗孵育的起始优化条件样本抗体单抗多抗组织5-25 ug/mL，4°C孵育过夜1.7-15 ug/mL，4°C孵育过夜细胞5-25 ug/mL，室温孵育1小时1.7-15 ug/mL，室温孵育1小时优势单抗原表位特异性工作浓度低劣势易受抗原表位的变化影响非特异性高，需经过抗原亲和纯化5.做石蜡切片IHC，推荐什么抗原修复技术??背景知识：日常工作中所使用的10％福尔马林固定的石蜡包埋组织，经常产生蛋白交联反应遮蔽了组织内某些蛋白抗原，阻碍了抗原与抗体的结合。为了打开蛋白间的交联，使被封闭的抗原充分暴露，抗原修复技术在免疫组化操作过程中是个极其重要的环节，不同抗原修复方法直接影响免疫组织化学染色结果的表达。?RD Systems建议客户采用热修复的方法，并提供了高度优化的抗原修复试剂，有效修复抗原并提高免疫反应的效果：碱性抗原修复液(Catalog # CTS013), 酸性抗原修复液 (Catalog # CTS014) ，中性pH 7.0抗原修复液(Catalog # CTS015) ，含有前3种修复液的综合修复液 (Catalog # CTS016)。在RD Systems的实验室中, 我们发现使用碱性抗原修复 (Catalog # CTS013)容易取得良好的修复效果。抗原未修复抗原修复后人小脑组织Neuroplastin 65一抗：3 μg/mL goat anti-human/mouse Neuroplastin 65 polyclonal antibody ：Catalog # AF5360抗原修复：Antigen Retrieval Reagent-Basic (Catalog # CTS013). 染色：Anti-Goat HRP-DAB Cell Tissue Staining Kit (brown, Catalog # CTS008) and count