全面的质粒抽提纯化疑难解答..docVIP

全面的质粒抽提纯化疑难解答 来源：生兴生物 质粒抽提该实验成功的标志是去除RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，得到相对纯净的质粒。 图：质粒大量抽提 1.常用试剂1）溶液I：EDTA：螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作辅基）。有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 （2）溶液II: 新鲜NaOH /SDS。新鲜III：醋酸钾（KAc）缓冲液KAc：用pH4.8的KAc溶液是为了把pH12.6的抽取液pH调回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol∕L KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷。减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀完全。 （4）苯酚/氯仿/异戊醇：沉淀蛋白质。酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。异戊醇其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 （5）乙醇：沉淀质粒DNA。此为实验中最常用的沉淀方法。DNA溶液时以水合状态稳定