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Safety of GMO Food GMO Food -2010 7 转基因食品安全检测：蛋白质水平 1）蛋白质印迹法(Western blot) 蛋白质印迹法将电泳较高的分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性结合起来，是检测复杂混合物中特异蛋白质的最有力的工具之一。普遍用于分离、检测特异的目的蛋白质，灵敏度为1 ng～5 ng。它可确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质，特别用于不可溶蛋白质的分析。 van Duijn等用蛋白质印迹法检测Roundup Ready大豆中的 CP4合成酶，检测限在0.5％~1％。验证该方法可对大豆蛋白质产品进行检测。 GMO Food -2010 7 转基因食品安全检测：蛋白质水平 2）酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)? ELISA检测是将抗原与抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用结合起来，根据酶作用于底物后的显色反应．当抗原与抗体结合时，借助于比色或荧光反应鉴定转基因成分。酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量呈正比。这是目前比较常用的两种检测转基因食品方法之一。 Rogan等用ELISA法检测出传统大豆加工产品中混有2％Roundup Ready大豆中的CP4 EPSPS蛋白质。 GMO Food -2010 7 转基因食品安全检测：蛋白质水平 2）酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)? 酶联免疫吸附检测方法具有高度选择性和灵敏性。免疫测定的主要缺点之一是复杂基质对它的准确性和精确度有干扰，如加工的蔬菜和食品。实际上，许多存在于食物基质中的物质，如表面活性剂(皂角苷)、酚化物、脂肪酸、内源磷酸(酯)酶，均可以抑制特异的抗原一抗体相互作用。 GMO Food -2010 7 转基因食品安全检测：蛋白质水平 2）酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)? 此外，外源基因表达的蛋白质在较低水平时或热处理变性时，免疫方法的检测能力下降。某些导入蛋白质并不是在植物的所有组织中均有表达，例如在玉米中一些蛋白质大部分表达在叶子中，而不在谷粒中。特别需要指出的是，在加工过程中蛋白质会发生降解，因此这种技术只适合未加工的原材料的检测。 如果导人的DNA的蛋白质没有表达，也不能应用这种技术。DNA比起蛋白质具有更多的热稳定性，能够在食物加工过程中存留。 GMO Food -2010 7 转基因食品安全检测：蛋白质水平 3）“侧流”型免疫测定(Lateral Flow)。 “侧流”型免疫测定是在最近15年发展起来的，该方法之前主要用于医学领域。与ELISA相似，这种测定方法也是基于三明治夹心式技术原理，但该法是在一种膜支持物上，而不是在管子里进行的，标识的抗原一抗体复合物侧向迁移，直至遇到在一种固定表面上的抗体。整个操作相对简单，目前市场上出现了用于侧流分析并能用于野外测试的试剂盒。 GMO Food -2010 7 转基因食品安全检测：核酸水平 1）普通PCR检测技术 普通PCR检测技术是在包括DNA模板、TaqDNA聚合酶、扩增引物、dNTP、缓冲液（包含MgCl2等）的反应混合物中，利用PCR仪对DNA片段进行扩增，PCR产物以指数方式增加。 GMO Food -2010 7 转基因食品安全检测：核酸水平 2）逆转录PCR(RT-PCR) 逆转录PCR ( reverse transcrip tionpolymerase chain reaction, RT-PCR)的原理是提取总RNA，以其中的mRNA为模板，利用依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR 扩增，获得目的基因。RT-PCR检测的灵敏性很高，可检测极为微量的RNA样品。RT-PCR广泛应用于遗传病诊断，食品安全检测等领域。 GMO Food -2010 7 转基因食品安全检测：核酸水平 3）巢式PCR 巢式PCR（nested PCR）是指利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。巢式PCR有两对PCR引物与检测模板配对，增加了可靠性和敏感性，缺点是容易被污染。 GMO Food -2010 7 转基因食品安全检测：核酸水平 4）多重PCR 多重PCR (multiplex PCR)原理与普通PCR基本一致，