维生素D受体基因多态性与慢性乙型肝炎患者的关联研究.docVIP

维生素D受体基因多态性与慢性乙型肝炎患者的关联研究 　　【摘要】 目的：探讨维生素D受体（VDR）FokⅠ基因多态性与慢性乙型肝炎患者临床表型的关联。方法：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）技术检测VDR FokⅠ基因的多态性在44例慢性乙型肝炎重度患者、46例中度患者和40例非活动性HBsAg携带者中的分布，并进行基因型分析。结果：慢性乙型肝炎重度组、慢性乙型肝炎中度组VDR FokⅠ基因的基因型与对照组（非活动性HBsAg携带者）比较差异有统计学意义（P0.01）；慢性乙型肝炎重度组、中度组与对照组VDR FokⅠ基因酶切位点的等位基因F/f分布存差异有统计学意义（P0.01）。Pearson列联系数=0.53，提示等位基因F/f分布与慢性乙型肝炎患者的不同临床表型存在相关性。慢性乙型肝炎重度组、中度组f等位基因分布频率高于对照组。结论：VDR FokⅠ基因的多态性与慢性乙型肝炎患者的不同临床表型存在一定的关系。 　　【关键词】 慢性乙型肝炎； 维生素D受体； 基因多态性； 免疫调节 　　慢性乙型肝炎（CHB）是以肝细胞损伤和肝组织炎性反应为主的疾病，乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝损伤及转归与机体的细胞免疫密切相关，主要以T淋巴细胞清除病毒和肝细胞的损伤为主[1]。1，25-二羟维生素D3[1，25（OH）2D3]是维生素D3的活性形式[2]。随着研究的深入，人们认识到它除了调节钙磷代谢外，还具有介导免疫反应作用，而这些功能的实现主要是由维生素D受体（ vitamin D receptor， VDR）来介导的[3]。本研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）的方法，初步探讨VDR基因多态性与慢性乙型肝炎患者不同临床表型的关系。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 选取2013年5月-11月本院感染科住院的慢性乙型肝炎现症患者90例，其中重度患者44例，男26例，女18例，平均年龄（37.4±12.5）岁；中度患者46例，男29例，女17例，平均年龄（35.4±10.5）岁。对照组选择同期本院感染科住院和门诊的非活动性HBsAg携带者40例，其中男27例，女13例，平均年龄（32.5±9.2）岁，全部患者均为生活在本地区的汉族人群，无血缘关系。诊断标准参照“慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版”，所有患者在3个月内未使用免疫调节剂和抗病毒药物，并排除合并其他病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化及肝癌等。全部患者均自愿参加本次研究。三组研究对象一般资料比较差异无统计学意义（P0.05），具有可比性。 　　1.2 方法 　　1.2.1 实验室检查 肝功能相关指标，包括AST/ALT、血清总胆红素TBIL、凝血酶原活动度PTA、血清白蛋白；检测HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和anti-HBc及HBV-DNA滴度。 　　1.2.2 基因组DNA的提取 留取慢性乙型肝炎中度及重度患者和非活动性HBsAg携带者空腹12 h后，晨起静脉采血4 mL（EDTA抗凝），采用硅胶柱纯化方式，用血液DNA提取试剂盒（D3741-01 美国OMEGA），从700 ?L抗凝血液中提取淋巴细胞基因组DNA。利用UV计测定所提取的DNA浓度及纯度，并将其稀释至10 ng/?L，分装保存于-20 ℃冰箱保存备用。 　　1.2.3 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP） VDR FokⅠ基因的引物序列：上游引物，5，-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3；下游引物，5，-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3。总反应体系均为25 μL：1 ?L基因组DNA，2.5 ?L 10×PCR 缓冲液，上下游引物各0.5 μL，dNTPs 2 ?L，0.25 ?L Taq DNA 聚合酶，去离子水18.25 ?L。VDR FokⅠPCR扩增条件：95 ℃预变性4 min；98 ℃变性10 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；72 ℃再延伸5 min。取扩增的PCR产物0.5 ?L，1 ?L限制性内切酶FokⅠ，及2 ?L 10×M Buffer， 2 ?L 0.1% BSA（由大连TaKaRa公司提供）及14.5 ?L灭菌水组成酶切总反应体系20 ?L，置于37 ℃水浴1 h，进行FokⅠ酶切，将酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以DL700 Marker为参考，紫外凝胶成像仪下观察结果。 　　1.3 观察指标 比较慢性乙型肝炎现症患者重度组、中度组和对照组VDR基因多态性的差异；VDR FokⅠ基因多态性与慢性乙型肝炎不同病情程度的关联程度。 　　1.4 统计学处理 分