散发性结直肠癌中CpG岛甲基化表型研究及其与微卫星不稳定的关系.docVIP

散发性结直肠癌中CpG岛甲基化表型研究及其与微卫星不稳定的关系 　　[摘要] 目的 研究散发性结直肠癌（SCRC）中CpG岛甲基化表型（CIMP）阳性的发生率及其临床病理特征，并探讨其与微卫星不稳定（MSI）的关系。 方法 采用甲基化特异性PCR（MSP）方法对91例散发性结直肠癌患者行P16、hMLH1、MINT1、MINT2和MINT31共5个基因启动子甲基化检测，分析散发性结直肠癌中CIMP阳性病例的临床病理特征。同时应用荧光标记多重PCR法扩增两个微卫星位点BAT25和BAT26，分析两个微卫星位点状况，探讨CIMP与MSI的关系。 结果 91例散发性结直肠癌患者中共检出CIMP阳性者22例，阳性率为24.2%。CIMP阳性者与CIMP阴性者相比，前者好发于近端结肠（P=0.02）、分化程度上低分化癌多见（P=0.03）、组织学类型上黏液腺癌或印戒细胞多见（P=0.04）。27.3%的CIMP阳性病例表现为MSI，54.5%的MSI病例表现为CIMP阳性（P=0.02）。 结论 CIMP的散发性结直肠癌具有好发于近端结肠、低分化癌及黏液腺癌或印戒细胞多见等特点，CIMP与MSI两者具有密切关系。 　　[关键词] 散发性结直肠癌；CpG岛甲基化表型；微卫星不稳定 　　[中图分类号] R735.3 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）26-0051-03 　　近年来研究揭示DNA启动子异常甲基化是抑癌基因转录失活的重要机制，Toyota等[1]提出CpG岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）的概念，用于反映多个抑癌基因的同时异常甲基化状态。微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）是基因组遗传不稳定的一个重要标记，在结直肠癌中MSI已成为筛查遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）的重要分子指标[2]，但在散发性结肠癌中，有关CIMP与MSI关系的研究国内外报道尚不一致[3，4]。本研究通过检测与结直肠癌密切相关的5个抑癌基因的启动子甲基化状态，研究散发性结直肠癌中CIMP阳性的发生率及其临床病理特征，同时探讨CIMP与MSI的关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料来源 　　收集浙江省肿瘤医院结直肠外科2009年1～6月份收治的手术切除91例结直肠肿瘤标本。所有病例术前均未行放疗和化疗，并有明确病理诊断，无肿瘤家族史。所有肿瘤标本均于手术切除后15～30 min内取材，并迅速转移至-80℃低温冰箱中保存。 　　1.2 DNA提取 　　采用酚/氯仿/异戊醇法提取基因组DNA。 　　1.3 MSP检测 　　按文献方法进行DNA的亚硫酸盐处理[5]，P16、hMLH1、MINT1、MINT2及MINT31 5个抑癌基因的MSP甲基化及非甲基化引物和反应条件见表1。PCR反应混合物包括：1×PCR buffer[16.6 mmol/L（NH4）2SO4，67 mmol/L Tris（pH 8.8）]，dNTP 0.4 mmol/L，MgCl2终浓度2.5 mmol/L，上下游引物各10 pmol，亚硫酸盐处理后的模板DNA（30～50 ng），用ddH2O补足体积至25 μL。95℃预反应5 min后加入热启动Taq酶（Hot-star Taq DNA多聚酶，Qiagen公司）0.75 U，之后94℃变性45 s，退火温度45 s，72℃延伸45 s，35个循环，然后72℃延伸7 min，4℃结束反应。以SssⅠ处理过的DNA（New England Biolabs，Ipswich，MA）作为阳性对照，以蒸馏水为空白对照，PCR产物以3%琼脂糖凝胶电泳，置于紫外线凝胶扫描系统中观察结果。MSP产物电泳时只出现未甲基化条带时为未甲基化，如出现甲基化条带则为甲基化。5个基因中有2个或2个以上基因同时出现甲基化条带者，该样本定义为CIMP阳性[4]。 　　1.4 MSI检测 　　选用BAT25和BAT26两个位点，PCR反应后将反应物在ABI PRISM 3730XL DNA测序仪上按仪器说明进行毛细管凝胶电泳，数据由GenScan3.1软件收集后进行分析。如果肿瘤组织DNA出现正常组织DNA没有的峰形判断为MSI。本研究按参考文献将BAT25、BAT26两个位点均为阴性定义为微卫星稳定（MSS），两个位点均为阳性定义为高度微卫星不稳定（MSI-H），单个位点阳性者定义为低度微卫星不稳定（MSI-L）[5]。 　　1.5 统计学分析 　　采用SPSS13.0软件分析，比较CIMP阳性者与CIMP阴性者两者的病理特征，并分析5个基因的甲基化及CIMP状态与MSI的关系。采用χ2检验与Fi