miR—106b对宫颈癌SiHa细胞运动侵袭功能的影响.docVIP

miR—106b对宫颈癌SiHa细胞运动侵袭功能的影响 　　[摘要] 目的 研究miR-106b对宫颈癌SiHa细胞转移侵袭功能的影响及作用机制。方法 SiHa细胞转染miR-106b inhibitors和mimics，实时定量PCR检测转染效率，Transwell及划痕法检测细胞运动侵袭功能，分析E-cadherin、PTEN、p-AKT（Ser473）蛋白表达情况。 结果 miR-106b inhibitors和mimics改变SiHa细胞中miR-106b表达。转染miR-106b inhibitors后，细胞迁移数、移动距离减少（P0.05）；PTEN及E-cadherin表达增强，p-AKT表达降低。转染miR-106b mimics后，细胞迁移数、移动距离增加（P0.05）；PTEN及E-cadherin表达降低，p-AKT表达增强。 结论 miR-106b可能通过E-cadherin/AKT、PTEN/AKT信号通路影响SiHa细胞运动侵袭功能。 　　[关键词] miR-106b；宫颈癌；转移；PTEN；E-cadherin 　　[中图分类号] R737.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0009-03 　　宫颈癌是女性第三大恶性肿瘤[1]，尽管人乳头瘤病毒（HPV）疫苗、手术、放疗、化疗等综合手段用于预防及治疗宫颈癌，但许多患者最终死于肿瘤的复发与转移。MicroRNA（miRNA）是一种只有21～25个碱基的非编码小RNA，它可以通过降解mRNA和（或）抑制翻译，于转录后水平调节靶蛋白的表达，发挥多种生物学功能，包括对肿瘤细胞转移侵袭恶性表型的影响[2-3]。有研究显示miR-143、miR-205、miR-106b等多种miRNA在宫颈癌中表达失调[4-6]。miR-106b在结肠癌、头颈部鳞癌、食管癌中高表达，并影响它们的转移侵袭等功能[7-9]。尽管其在宫颈癌组织中高表达，且其表达受HPV的E6、E7的调节[10]，但其对宫颈癌的生物学行为的影响目前未见报道，因此本文旨在研究其对宫颈癌细胞转移侵袭功能的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　宫颈癌细胞SiHa购自美国ATTC。DMEM培养基购自美国Gibco公司。脂质体2000购自美国Life Technologies公司。Matrigel购自美国BD Co.公司。Transwell小室购自美国Costar，Corning Inc.公司。miR-106b inhibitors、mimics以及阴性对照购自美国Dharmacon公司。E-cadherin、PTEN、p-AKT（Ser473）、β-actin购自美国Santa Cruz公司。Trizol购自美国Invitrogen公司。miR-106b反转录引物及实时定量PCR扩增引物、反转录试剂盒、TaqMan MicroRNA试剂盒、U6 snRNA 购自广州锐博公司。 　　1.2 miR-106b inhibitors、mimics转染SiHa细胞 　　将SiHa细胞接种于6孔板中。按照脂质体2000说明书进行miR-106b inhibitors、mimics的转染，实验组命名为106b inhibitor和106b mimic，并设置阴性对照（inhibitor NC和106b mimic NC）、空白对照（blank，即未转染的SiHa细胞）。转染6 h后换新培养基，继续培养24 h，用于后续试验。Real-time PCR检测转染效率。 　　1.3 Real-time PCR 　　应用Trizol抽提总RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，应用TaqMan MicroRNA试剂盒对cDNA进行实时定量PCR反应，反应条件：95℃ 1 min 变性，95℃ 15 s，60℃ 20 s，70℃15 s，40循环，U6为内参照。每一实验重复3次。 　　1.4 Transwell实验 　　转染24 h后细胞进行Transwell实验。小室的上室铺Matrigel 50 μL，凝固后小室的上室加入含2×105细胞的100 μL培养液（不含血清），下室加入10%胎牛血清DMEM培养液0.5 ml，置孵箱培养24 h。取出膜，拭去膜上层细胞，甲醇固定，苏木精染色，高倍镜下计数穿膜细胞数。取3个不同视野计数，重复3次实验。 　　1.5划痕实验 　　转染24 h后细胞达95%融合度时，用小移液器滴头划痕。PBS洗3次。标记，改用无血清DMEM培养，Nikon倒置显微镜镜下记录划痕宽度并拍照。24 h后观察划痕愈合情况。重复3次实验。 　　1.6 Western blot实验 　　收获各组细胞，加入1