促红细胞生成素对小鼠心肌缺血损伤的心脏保护作用及机制.docVIP

促红细胞生成素对小鼠心肌缺血损伤的心脏保护作用及机制 　　[摘要] 目的 探讨类似促红细胞生成素（EPO）对小鼠心肌缺血损伤的保护作用。 方法 采用结扎冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。治疗组大鼠（n=40）采用腹腔注射方法给予EPO（1 μg/kg），对照组大鼠（n=40）在相同的时间点给予等量的生理盐水。处理后24 h通过TCC染色测量心肌梗死面积，处理后3、24 h，通过Western-blot法检测STAT3蛋白表达。处理8周后，通过超声心动图测量左心室舒张期末容积、左心室收缩期末容积、左心室射血分数。 结果 治疗组小鼠心肌梗死面积为24.6%，对照组小鼠心肌梗死面积为48.6%（P<0.05）；EPO干预后，与对照组比较，治疗组STAT3蛋白表达增高（P<0.05）；治疗组左心室舒张期末容积、左心室收缩期末容积、左心室射血分数分别为592 μl、371 μl、36%，对照组上述指标分别为740 μl、526 μl、27%，两组差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 EPO在小鼠心肌缺血损伤中具有心脏保护作用。 　　[关键词] 促红细胞生成素；心肌梗死；信号转导子与转录激活子3 　　[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0020-03 　　近年来研究表明促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）具有多种非促造血方面的细胞保护作用，特别是在抑制心脏重构方面的作用日益受到关注，但其作用机制目前尚不十分明确，可能与抑制心肌细胞肥大和凋亡、抗炎、抗氧化、抑制成纤维细胞增殖等有关[1-2]。也有报道显示其细胞保护作用与抑制胶原合成及影响基质金属蛋白酶活性等方面有关[3-4]。本实验拟在探讨EPO在心肌缺血损伤中的保护机制，为临床应用EPO防治缺血再灌注引起的心脏功能损伤提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物及材料 　　取雄性Sprague-Dawley小鼠120只，8周龄，由南昌大学动物实验中心制备成急性心肌梗死（AMI）模型，全部小鼠分3组，分别为对照组（40只），重组人促红细胞生成素（rhEPO）组（40只），假手术组（40只）。对照组小鼠诱导心肌梗死模型后给予生理盐水，rhEPO组小鼠诱导心肌梗死模型后输注rhEPO，假手术组在前降支留置一松结，不结扎。重组人红细胞生成素注射液（益比奥，批号，沈阳三生制药有限公司），兔抗STAT3、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 均购自美国Santa生物公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 大鼠AMI模型的制作 参照Olivetti等[5]的手术方式结扎冠状动脉左前降支制作AMI模型。假手术组仅在前降支留置一松结，不结扎。所有动物均分笼饲养，标准饮食。 　　1.2.2 EPO的心肌保护作用检测 在结扎后5 min 接受腹腔注射rhEPO（1 μg/kg）（n=10）[6]，存活小鼠在24 h后处死，通过TCC染色测量心肌梗死面积。取新鲜大鼠心脏，用PBS缓冲液冲洗，滤纸吸干，-20℃冰冻30 min后将其横断面切成1～2 mm 切片，1%TTC37℃染色25 min，切片放4%甲醛中过夜以增强颜色对比，非心肌梗死区染色为红色，梗死区不染色。扫描仪扫描心脏切片，使用image proplus6.0软件测量相关区域面积，梗死面积（%）=左心室组织切片梗死区面积/左心室组织切片总面积×100%。 　　1.2.3 STAT3蛋白表达 选取2组小鼠诱导心肌梗死模型后（n=20），分别用rhEPO（1 μg/kg）、生理盐水进行处理（方法同1.2.2），手术处理后的存活小鼠在心肌梗死后3、24 h处死。通过组织颜色改变鉴别心肌缺血组织和正常组织，进行组织切片后放入液氮冷冻，采用Western blot方法测定转录激活因子3（STAT3）。取大鼠左心室梗死边缘区心肌组织标本液氮研碎，加入裂解液，匀浆离心后，取上清液用BCA法测定蛋白浓度，变性后-80℃冰箱保存。取各组样品50 μg，进行12% SDS电泳将总蛋白电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温摇床封闭1.5 h后，加入一抗稀释液稀释的STAT3（1∶500）单克隆抗体，4℃冰箱中孵育过夜，用TBST洗涤15 min×3次，加入二抗（HRP标记二抗，1∶5000稀释），室温下摇床孵育1.5 h，用TBST洗涤15 min×3次。ECL发光液显色，胶片扫描后用Image J软件进行图像分析，以β-actin（1∶1000稀释）作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。 　　1.2.4 大鼠心功能测定 冠状动脉结扎后5 min内腹腔注射rhEPO1 μg/kg（n=10），生理盐水1 ml/k