HRM操作流程.doc

HRM的应用 2010-10-22 10:05阅读(378)评论(0)?? ?高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。 1． ?原理 ??????? HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。 HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。 ??????? 以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。 ? ??? 如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。 ????? 下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图： ? ??? 以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。 ?????? 下图是采用 Lightscanner 仪器对纯合子，杂合子，双杂合样品的分析结果。 ? 图三 . 采用 Lightscanner 系统对标准样品的分析。灰色的曲线代表的是纯合子样品，红色的曲线代表的是杂合子样品，蓝色的曲线代表的是双杂合样品，通过 Lightscanner 系统的分析，三种样品被明显的分为了三类，表现出了极高的灵敏性和准确性。 2.??应用 HRM技术可以用于以下两方面：突变筛查和基因分型。下面将详细的讲解这两种方法。 2.1 突变筛查 所谓突变筛查指的是寻找目的片段中的未知SNP位点。由于杂合子与纯合子的熔解温度不同，根据产生的曲线形状的不同判断样品可能存在SNP位点。具体如下图所示： ?? 此方法的要求是： a：要求目的片段150-400bp。 b：在PCR反应之前加入LC Green。 c：要求模板的量要均一，引物的特异性要好。 d：反应体系为10ul， LC Green的加入量为1ul。 e：在PCR反应之前应加入矿物油25ul。 推荐反应体系下： 操作步骤如下： ． 配制PCR缓冲液。 ． 进行梯度实验。梯度实验分两步：第一步不加LC Green，确定引物是否能用。第二步加LC? Green，确定加染料后的退火温度。一般加染料之后的退火温度会高于不加染料的5左右（取决于引物的特异性）。 ．用优化好的PCR条件扩增模板。推荐反应程序为： ．双击Lightscanner图标，打开文件。点击“RUN”，设置扫描程序。将反应之后的96孔板放入LS96中进行扫描。等待温度升到待机温度，将96孔板插入到机器内，注意有切角的一端先插入，待门关好。点击“Start Run”，弹出一个窗口，用来储存文件。 软件对数据进行收集。 ? ． 分析结果。打开LightScanner软件：在桌面上点击LightScanner的图标。打开要分析的数据：?? 点击“Scanning”后会弹出一个窗口，然后选择要分析的数据，打开。对数据进行分组（如果不需要分组的话直接进入下一步）。点击软件左上角的“Subsets”，然后点击软件中部的“New Subset”按钮，此时软件自动记录为第一组。在Sample Selection里选择要分入到第一组的样本，然后点击软件页面下方的“Add Marked to Subsets”，此时，第一组分组完毕。如果还需要分组，再点击“New Subset”按钮，此时软件自动记录为第二组，选择要分入第二组的样本，点击“Add Marked to Subsets”，此时，第二组分组完毕。如果需要更多分组，重复以上操作直至分组完毕。 对样品进行命名：点击软件上方的“samples”，软件右侧显示出一个表格，可以对样本进行注释或命名。如果不需要，可以直接跳过此步骤。 对选定的组进行分析：点击软件上面的“Scanning”，软件左侧中部出现一排操作选项，按照顺序依次点击就完成对样品的分析。首先出来的是“Negative Filter”，用来选择阴性或者阳性结果，选择