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单克隆抗体与基因工程抗体制备 多克隆抗体(Polyclonal antibody) 概念 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清，是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的，称为多克隆抗体。 存在的问题 为不均一物质特异性和亲和力差, 批间重复性差， 用于免疫学检测容易出现交叉反应 单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb) 概念: 通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体. 特点: 针对单一表位 结构相同 功能均一 杂交瘤技术的理论基础 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞， 杂交瘤技术流程 两种亲本细胞的选择与制备 细胞融合 杂交瘤细胞的筛选与克隆化 两种亲本细胞的选择与制备 小鼠骨髓瘤细胞 免疫脾细胞 骨髓瘤细胞系选择要点： 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清） 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％ 　 一般要求 ： 与骨髓瘤细胞同源的小鼠（ Balb/c小鼠） 8～12周龄 20g～25g体重 用高纯度高活性抗原刺激免疫小鼠 免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂， 10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）。冲击免疫（融合前3天进行） 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 细胞融合 当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。 骨髓瘤细胞 PEG 杂交瘤细胞 脾细胞 细胞融合剂： PEG 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同 免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。 融合比例： 骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10 融合剂：40%PEG（分子量1000-2000） 融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液 融合后细胞的类型: 未融合的脾细胞 （寿命短，5-7天死亡） 杂交瘤细胞 （分泌抗体和永生性） 未融合的瘤细胞 杂交瘤细胞的筛选与克隆化 细胞DNA合成途经 1.替代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT 2.主要途径： 氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸 谷 氨 酰 胺 （A-） 尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T） HAT选择培养基的原理 HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T) 融合后不同细胞在HAT培养基的结果及命运 阳性杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞在HAT中生长，其中仅少数是分泌特异性McAb的细胞，而且有的培养孔生长多个细胞群落，必须筛选。 一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。 可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。 克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。 克隆化的原则：尽