microRNA定量研究实验指南.doc

HaiGene miRNA定量整套解决方案 ----miRNA提取、反转录、RealTime PCR 前言 对miRNA进行定量研究的经典方法是ABI公司的探针法，其采用特殊结构的茎环反转录引物对miRNA进行反转录，之后采用MGB探针进行RealTime PCR定量分析，这种方法具有特异性高、定量准确的优点，但是试验需要订购ABI公司的成套的引物试剂，成本很高。2008年Soroush首次报道了miR-Q技术【1】，该技术使用了含有tag的特异性反转录引物，这样可以很好的区分相似度很高的miRNA（原理如图1A）。2011年Peter对miR-Q技术进行了改良【2】，对miRNA进行加A后，采用含tag和oligo dT的引物进行反转录，之后采用含特异性序列的上下游引物进行RealTime PCR（原理如图1B），这样保证了miRNA的扩增特异性，其可以很好的区分单个碱基差异的miRNA【结果如图2所示】。实际的大规模应用中也表明该方法确实可以有效的对miRNA进行定量研究，其结果的可靠性可比拟探针法【结果如图3所示】，已经被大量研究者所采用【3~13】。 图1A miR-Q技术原理；图1B Peter改良的miR-Q技术原理 图2：使用Peter改良的技术能够有效的区分相似度很高的miRNAs 图3：使用Peter改良的技术能够高效的扩增miRNAs 海基优化的miRNA定量方案是在Peter改良的技术方法基础上建立起来的，包括三部分：高效提取miRNA、通过加A法反转录获得miRNA的cDNA、应用SYBR Green染料法对获得的cDNA产物进行RealTime PCR扩增。采用该实验方案进行miRNA表达研究结果可靠、操作简便、重复性高、耗时短、费用低，操作流程如图4所示。下面将该方案的使用特点和方法进行详细阐述。 图4 HaiGene优化的miRNA qRealTime PCR定量方案 第一步 miRNA的提取 核酸的提取往往是研究过程的第一步、是实验的基础。核酸提取的成功与否、提取质量的高低对后续实验起着至关重要的作用。获得良好的实验材料后，后续的实验将事半功倍，这一步不能马虎。目前miRNA的提取主要采用三种方法： Trizol法 使用TRIzol试剂提取总RNA，对总RNA中包含的部分小RNA进行研究，该方法的缺点是总RNA中miRNA的比例较小，同时由于mRNA的干扰，会导致后续反转录和RealTime PCR实验效率很低，很难获得理想的实验结果，而且结果并不可靠。 离心柱式法 利用特殊的吸附材料将总RNA结合在离心柱的吸附基质上，将大分子mRNA洗涤去除后，再将miRNA洗脱下来，从而获得纯度较高的miRNA。由于miRNA分子较小（20nt左右）所以其吸附基质的能力较差，从而导致提取效率很低，造成20nt左右的miRNA分子大量丢失。 HaiGene全新一代miRNA提取法 HaiGene公司研发团队在探索miRNA分子功能的过程中，开发出一套全新的miRNA提取方案。可直接从细胞、组织、全血等材料中提取纯度高达97%的miRNA（15-200nt），并且其提取过程中可获得更多的小分子miRNA，少量的样品也可获得理想的实验结果。更为重要的是，该方法操作极为简单、步骤较少、适合于高通量提取，2h内可完成24个样品的提取工作。 采用HaiGene miRNA提取试剂盒提取高纯度小RNA操作方法【HaiGene，Cat.No.:B1801】 1. 组织样本提取 (1) 向1.5ml EP管中加入300μl miRNA Reagent A。植物组织则再加入10μl β-巯基乙醇，混合均匀。 (2) 在液氮条件下充分将组织研磨粉碎，将一定的样品量（见样本使用量表）研磨成粉状的组织加入到上述300μl miRNA Reagent A中，立即手腕用力震荡至组织粉末彻底溶解于裂解液中。室温静置5min以充分裂解细胞。 注意：将组织加入到miRNA Reagent A后要迅速将组织震散，否则易引起组织成团状，不容易裂解。如发生成团状，务必用移液器将团状组织吹打松散。 (3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入350μl miRNA Reagent B，手腕用力震荡混合均匀，室温放置5min。 (4) 13,000rpm离心5min，吸取550ul上清液，转移到新的1.5ml EP管中。 (5) 向上述溶液中加入200μl 无水乙醇，手腕用力震荡数次，4℃放置5min。 (6) 13,000rpm离心10min，转移700ul上清液到新的1.5ml EP管中。 (7) 向上述溶液中加入70