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酶标板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板机，注射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗 了解转膜电泳原理的应用及操作 Western Blotting or immunoblotting a specific primary antibody 1979, Towbin 1975, Southern, Southern blotting 1977, Alwine, Northern blotting 1979, Towbin, Western Blotting 1982, Reihart, Eastern blotting ,双向蛋白质印记 * * 实验五 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价 ? 1.目的要求 (1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。 (2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及酶联免疫测定仪的使用。 2.基本原理 免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定Ab/Ag。 免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应 酶促反应：只进行一次 显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg 60年代初期，Averameas Ram等 建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。 1974年 Voller等 用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标记物结合 操作更方便，易重复 灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)， (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 免疫标记技术 应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定 标记抗体或抗原 荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂 镜检观察或进行自动化测定 荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等 直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究 酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测 常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。 酶标技术 戊二醛法， 过碘酸氧化法 将酶与Ab交联在一起 Ag-Ab-抗Ab-HRP TMB+H2O2 产物（黄色，OD450)+H2O 图一　　直接型Elisa 图二　　间接型Elisa 图三 双抗体夹心型ELISA 图四 固相抗体竞争型ELISA 未知抗原量=A（1）-A（2） 每次反应后都要反复洗涤？ 保证反应的定量反应 防止重叠反应，引起非特异现象。 Partially purified, inactivated HIV antigens antigens pre-coated onto an ELISA plate 部分纯化，灭活病毒抗原 抗原涂到酶标板 Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.病人血清中含有抗体。如果病人是艾滋病毒+，那么这个血清含有艾滋病毒抗体，这些抗体可以绑定到病毒抗原板 Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体，并结合人类抗体 substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody. 基板而改变颜色，当裂解酶附二抗体 HIV (human immunodeficiency virus) detection positive negative Protein protein i