抗原抗体反应的应用.pptVIP

第三节 抗原抗体反应的应用 一、免疫沉淀与免疫凝集 二、免疫标记 三、免疫定位分析 四、抗原抗体反映的其他应用 一、免疫沉淀与免疫凝集 溶液中的环状沉淀试验 在体外可溶性抗原与相应抗体形成肉眼看见的沉淀物。 在液相中形成的沉淀不容易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于观察。 2. 凝胶扩散沉淀 抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子与抗体分子在凝胶介质中自由扩散，相遇形成沉淀。 以琼脂扩散实验较为常用。 单向免疫扩散：抗体混于琼脂中，小孔中加入抗原，抗原向周围均匀扩散，与抗体形成沉淀环。可用于定量测定免疫球蛋白和补体的含量等。 双向免疫扩散：抗原和抗体向周围扩散后可在两孔之间形成白色沉淀线，可用于抗原或抗体的定性检测。 缺点：时间长，灵敏度低。 单向免疫扩散：常用于测定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。 3.电泳条件下的沉淀反应 血清免疫电泳：患者血清和正常人血清分别放在凝胶上近负极端的小孔中进行电泳分离后，在两种抗原之间沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清进行双扩散。 火箭电泳：单向免疫扩散与电泳结合的一种方法。在电场作用下抗原向正极扩散，与抗体形成沉淀峰（火箭型沉淀线）。需时短，能检测微量抗原。 对流电泳(电渗析)：在电场作用下抗原与抗体相对扩散，形成沉淀线。对流电泳较双扩快速和灵敏。 4.免疫共沉淀 5.免疫凝集 大颗粒性抗原如细胞或细菌等与相应的抗体结合后能使康媛颗粒发生凝集，形成肉眼易见的凝集小块，即为免疫凝集。 凝集反应的发生分为两个阶段：1、抗原抗体的特异性结合阶段；2、出现肉眼可见的凝集现象。 最常见的免疫凝集反应是红细胞凝集，即血凝反应。 血凝反应的抗体识别的抗原可以是红细胞表面的天然抗原，如血凝鉴定试验；也可以通过交联将红细胞连接上其他抗原，如早期的HBsAg血凝试验。 细菌的血凝试验常用来 对细菌进行鉴定与分型，如沙门菌鞭毛抗原的分析等。 免疫凝集试验虽然简便，但是受反应灵敏度的限制，在实际应用越来越少。 二、免疫标记 免疫标记技术：将已知抗体或抗原标记上易显示的物质（示踪物），通过检测标记物反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。 目前有四种方法： 放射免疫分析法：以同位素为示踪物，为最灵敏、可靠的免疫标记技术。 酶联免疫吸附试验（ELISA） 荧光与发光免疫分析 亲和标记的免疫分析 标记免疫技术= 1.放射免疫分析法 标记同位素：125I，131I、3H和35S 检测方法： 液相体系用液体闪烁仪计数； 固相体系用X射线胶片显影。 直接法与竞争法 竞争法基本原理 采用定量的标记抗原（Ag＋）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。 2.酶联免疫吸附试验（ELISA） ( enzyme linked immunosorbent assay) (1) 定义：抗原与抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物。 (2) 测试方法：可目测或用分光光度计比色进行定性或定量检测。 (3) 测试过程 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成） 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应） 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离） 加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应） (4) ELISA技术类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物。 ①双抗体夹心法(直接夹心法） 特点： 非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 ②间接法 ③捕获法（反向间接法） 主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。 ④直接法 用酶标记的抗原或抗体直接检测包被在酶标板上的抗体或抗原，其量与产物颜色成正比。 3、均相酶免疫吸附测定 基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检