chapter+12-15+nucleic+acid.ppt

* 人體基因序列 是一浩大工程，共有三億多個鹼基序列，在二○○一年已經完成初稿，是一部蘊藏著人類生命奧祕的『有字天書』，也開啟了『基因體學 genomics』及『生物資訊學 bioinformatics』的時代。細胞核的染色體中記憶著所有核酸序列，若以磁碟片或光碟代表細胞核中的核酸資訊，則此磁碟可以分成 46 個檔案夾，類似人類的 46 條染色體，磁碟容量須達 3,000 M 位元。 除了紅血球沒有細胞核，以及精子或卵子細胞只含有一半染色體，我們身體上每個細胞，都攜帶有上述的完整遺傳資訊，理論上都可以重新建構一個新的個體。 但只有完整的遺傳訊息，可能還不足以啟動發育成完整的生物體，染色體上的基因需要有種種調控系統，以協調並組織生物體的正常發育過程。有點像你擁有一片光碟，裡面有 46 首音樂的資訊，但必須放在光碟機中播放，才會產生音樂；光碟機可以啟動光碟，並有解讀資訊以轉換成聲波的功能。 基因序列剛解碼時，所得到的序列都只是初步的草圖，並且有許多地方無法定出。 除了要仔細比對確認序列，並且開始檢查核酸序列的意義，例如找出每個基因的首尾，確定其 intron/exon 位置。 如此經過定義註解後的序列資料，對科學家才有進一步的用處，可以開始使用電腦進行種種序列上的運算與比對，就是生物資訊學的範疇。 石蜡油 蛋白质 开环形及线性DNA 闭环形质粒DNA RNA 用垂直转头65000转6h，角转头45000转36h。 离心后，蛋白质在最上面，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉淀较快，开链或环形DNA沉淀较慢。 此法分离的DNA纯度较高，可供DNA重组等实验用。如需更纯品，可再进行一次氯化铯密度梯度离心。 2.2 密度梯度离心法 2.3 柱层析法 常用的支持体为二乙胺乙基（DEAE）纤维素（离子交换），葡聚糖凝胶等（凝胶过滤）。 因为核酸和核苷酸是两性电解质，在一定的pH值条件下各解离基团的解离情况不同，即有与蛋白质相似的等电点。 2.4 凝胶电泳法 不同种类的核酸分子所带电荷与其质量之比都非常接近，故用一般电泳方法不易分开。 若以某些凝胶为支持体进行电泳，由于凝胶的分子筛作用可影响不同核酸分子的泳动速度，则可得到较好的分离效果 。 琼脂糖凝胶电泳图 0.14mol法（DNA的提取）: 处理方法 结果 浓NaCl溶液（1-2M） 提取组织中的核蛋白 稀释至0. 14mol 后 DNA核蛋白的沉出 RNA核蛋白则不沉出 浓NaCl 溶解DNA核蛋白 氯仿或酚 除去其中的蛋白质 乙醇沉淀 提取溶液中的DNA 蔗糖密度梯度离心法 分开各种DNA CSCl或Cs2SO2浓溶液的密度梯度离心法 分开单股和双股DNA 2.5 核酸的分离小结 2.6.1 紫外法分析核酸 纯DNA的OD 260/280≥1.8。 纯RNA OD 260/280≥2.0，如果样品中含有杂蛋白，比值会明显下降。 如果OD 260/230≥1.8时样品是纯的，否则样品中含有杂多糖。通常1.0OD相当于50μg/mL的双螺旋DNA或 40 μg/mL单链DNA（或RNA）或20 μg/mL寡核苷酸 。 1965年Robert Holley首先用测蛋白质氨基酸的序列方法（重叠法）测定了酵母丙氨酸tRNA的序列。 1977年两位学者提出了化学裂解法和双脱氧酶法。这两种方法的基本原理相同，都是用不同的专一性手段使被分析的DNA分子断裂成若干带放射性标记的、长短不一的片段，然后用测DNA片段的相对长度来测核苷酸的顺序。即利用凝胶电泳使各种片段分离，再用放射自显影法显影。从放射自显影图谱读出被测核苷酸的序列。 2.6.2 核酸测序 化学法测定DNA序列时的G反应 32 P 32 P 32 P 32 P 用硫酸二甲脂修饰碱基 加热使修饰后的碱基脱落 T A C G T A G C T A C G T A G C T A C T A G C T A C T A G C CH3 用碱切断DNA骨架 标记切断 *GATCGGACCT *GATCGGACC *GATCGGAC *GATCGGA *GATCGG *GATCG *GATC *GAT *GA *G G G+A T+C C G 反应 G+A反应 T+C反应 C反应 pGpApTpCpGpGpApCpCpT 化学法测定DNA序列时的G反应 双脱氧酶法测定DNA顺序 待测序列 A T T A G A C G T C C G T G C A A T G C 3， 5， 引物及固定端 加引物 A C G T T A C G 3， 5， A T T A G A C G T C C G T G C A A T G C A C G T T A C G 3， 5， 3， 5， ① ② 以2，、3，－双脱