第三章 细胞工程.pptVIP

封闭式连续培养，新鲜培养液和老培养液以等量进出，并把排出的细胞收集，放入培养系统中连续培养，所以培养系统中的细胞数目不断增加；开放式连续培养，恒化法，恒浊法 * 恒化培养，控制培养液流速，生长因子有，培养流速恒定，生长速度低于最高生长速度，产物是不同生长速度的菌体，应用以实验室为主；恒浊培养，控制对象菌液密度，生长限制因子没有，培养液流速不恒定，生长速度为最高生长速度，产物为大量菌体或代谢产物，应用范围以生产为主 * DMSO二甲亚砜 * 17%的蔗糖 * 原生质体 原生质体制备之前，微生物细胞需经过种子培养，振荡培养到对数期为宜。 一般而言，对数生长期的菌体容易被相应的酶酶解脱壁，原生质体的生成率最高。 其他时期原生质体的生成量会有比较大的不同，特别是稳定期，其得率会急剧下降。 原生质体形成以后，就必须使其处于一个适当渗透压的环境中，这样才能免于破裂。 注意： 原生质体对渗透压敏感，因此，在琼脂平板上涂布培养后其会在低渗条件下破裂失活，不能形成菌落，菌落越少，说明原生质体化效果越好。 原生质体形成率=原生质体数/未经酶处理的总菌数 3.2.2微生物原生质体融合 融合：就是把两个或多个亲本的原生质体混合起来，使其形成融合子的过程。 最常用的融合方法是PEG融合和电融合。 以PEG为例说明融合过程： ①作好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。 ②原生质体的密度为105个/ml左右，两种原生质体按照1∶1等量混合，离心去除上清液，沉渣置于高渗稳定液中，加40%PEG，用滴管轻轻吹打，使细胞分散均匀。 ③适当温度水浴保温一定时间，稀释。 ④取少量最后稀释液涂布到高渗再生平板上，培养。 ⑤检查 4.2.3微生物原生质体的再生 原生质体再生：使原生质体重新生长出细胞壁，回复到完整的细胞形态的过程。 原生质体再生是使用原生质体融合进行育种的一个必要环节，如果原生质体化后不能再生，不能生成完整的细胞，则就失去了意义。 原生质体再生的条件较为严格，而且不同的微生物又有所不同。 共同点—需要高渗环境。 原生质体能再生细胞壁，回复到细胞形态的总只是其中的一部分。 为了得到较高的再生率： a:在试验过程中，操作条件温和，避免因为机械力量引起原生质体破碎； b:再生用平板培养基在涂布前，应先除去培养基表面多余的冷凝水； c:原生质体的再生活性和制备中的一些条件密切相关，如菌龄、酶的用量、酶作用时间等； d:原生质体再生培养阶段外加某些物质可以提高原生质体的再生率，一般是加入细胞壁合成的引物。 4.2.4微生物融合子的筛选 融合子：原生质体融合后，来自两亲本的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代细胞。 筛选方法 直接法：微生物原生质体融合中较常用。对于营养互补型的亲本，可从高渗再生基本培养基（不补充两个亲本必须营养物）上直接筛选；对于抗药性作为选择标记的融合，可从含药物的平板上分离鉴定。 间接法：把融合液涂布在高渗再生完全培养基上，使亲本细胞和融合子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出融合子。 融合后获得的仅仅是融合子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定是否符合育种要求。 3.3微生物原生质体融合的优点 ①有较高的诱变率 去除了细胞壁的障碍，诱变效率比较高，特别是对一些本来对诱变剂作用不敏感的微生物。 ②重组子类型多 原生质体融合后，两个亲株的整套基因相互接触，可以有充分的机会发生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子，而且参与融合的亲株数不限于两个，可以是三个、四个等。 ③有较高的融合率 借助各种方法，可以得到较高的融合率。 ④可以与多种育种方法结合使用 ⑤与较高的筛选率 可以用温度、药物和紫外线照射等处理钝化亲株的一方或双方，然后再使之融合，这样可以在筛选中除去某一亲株一方的不良性状，提高筛选效率。 5.固定化细胞技术 5.1细胞固定化的定义和意义 细胞固定化：是指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。 固定化技术最早在酶工程中得到应用。 酶具有催化反应专一性强、催化效率高、反应条件温和等优点。但实际生产中，由于其价格昂贵，传统分批式操作使得有活性酶的回收比较困难，而且在有