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《现代色谱分析》讲 稿 第四章、|HPLC法 第一节、概述 一、HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径1-3cm，固定相粒径100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测 2．HPLC：分离和分析 柱内径2-6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测 3、HPLC法与经典LC性能对比 P170 表4-1 二、HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 续前 2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 三、HPLC的特点(P170) “三高” “一快” “一广” A滞留在流动相中的时间分数，即为保留比 HPLC优点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。(适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。) 缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 四、高效液相色谱仪流程图 四、HPLC的分类 P171-2 思考题 从分离效率、分离速度、灵敏度、样品容量、操作技术等方面，列表比较经典液体柱色谱、气相色谱、高效液相色谱的异同点。 第二节 基本原理 内镶嵌极性基团亲水, 形成水屏蔽层。 优点：屏蔽了硅羟基的吸附作用；亲水 二、定性参数 1.??保留时间 ⑴保留时间“ tR”：进样至出峰的时间。 ⑵死时间“ t0”：不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间。 死时间“ t0”的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫 外吸收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳， 反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等。 ⑶保留体积：VR＝tR?FC ( FC --- 流动相的流速 mL/min ) VR 是在 tR 时间内流动相流过柱子的体积。 调整保留时间：tR’＝ tR－t0 调整保留体积：VR’＝ VR－V0＝tR’ ?FC 衡量柱效能的指标 n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为 3．分配系数和容量因子的关系 4. 分配系数和容量因子与保留时间的关系 设流动相的线速度为u，组分的速度为v，将二者之比称为保留比： ［例 1］在一根10cm长的色谱柱上测得两组分的分离度为0.68,要使它们完全分离以(R=1.5),则柱长应为多少？ 即在其他操作条件不变的条件下，色谱柱长要选择50cm左右才能使分离度达R=1.5,组分达到完全分离。 [例2] 已知某色谱柱的理论塔板数为3600,组分A和B在该柱上的保留时间为27mm和30mm,求两峰的半峰宽和分离度.  例4 组分A在柱内的移动速度只有流动相速度的1/10，柱内液体流动相体积为2.0ml，固定相体积为0.5ml。求流动相流量为10ml/min时，组分A停留在固定相中的时间和它的分配系数。 R=1/1+k = 0.1