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NGS系列讲座（一）——NGS简介及原理 2017/06/01 魏冬凯 Outline 二代测序技术背景 Solexa测序原理 Outline 二代测序技术背景 Solexa测序原理 其他平台测序技术简介 什么是DNA测序？测序的研究对象是什么？ DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。 ——百度百科 测序主要研究的是DNA一级结构，不涉及DNA的二级、三级结构 DNA合成的基本过程 dNTP ddNTP 一代测序 末端终止法（ABI 3700） 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用荧光染料标记4种不同的碱基，通过计算机自动读出。 Frederick “Fred” Sanger Sanger测序 Sanger 测序 G T C T T G G G C T Sanger 测序 G T C T T G G G C T A G C G C 21 bp Sanger 测序 G T C T T G G G C T A G C G C 5’ 21 bp 26 bp G T C T T G G G C T A Sanger 测序 G T C T T G G G C T A G C G C 5’ 21 bp 26 bp 5’ G T C T T G G G C T A 22 bp G Sanger 测序 G T C T T G G G C T A G C G C 5’ 21 bp 26 bp 5’ G T C T T G G G C T A 22 bp 5’ G 12 bp G T C T T G G G C Sanger 测序 G T C T T G G G C T A G C G C 5’ 21 bp 26 bp 5’ G T C T T G G G C T A 22 bp 5’ G 12 bp 5’ G T C T T G G G C 20 bp G T C T T Sanger 测序 G T C T T G G G C T A G C G C 5’ 21 bp 26 bp 5’ G T C T T G G G C T A 22 bp 5’ G 12 bp 5’ G T C T T G G G C 20 bp 5’ G T C T T 16 bp Sanger 测序 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? C 5’ ? ? ? ? ? ? ? ? ? T 21 bp 26 bp 5’ ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? A 22 bp 5’ G 12 bp 5’ ? ? ? ? ? ? ? ? C 20 bp 5’ ? ? ? ? T 16 bp Sanger 测序 Laser Reader Sanger 测序 Sanger测序的特点 测序长度500-1000bp。 通量低，每次测序最多获得1kb数据，如果测大基因组，成本极高。 错误率高，PCR带来错配。 测序基于PCR反应，需要引物，并且有些些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。 1990 年 10 月美国确定把当年的 10 月 1 日作为官方实施 HGP 的起始日期，被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。 2000年完成草图，2003年正式完成。 全部人类基因组约有2.91Gbp，约有39000多个基因。 目前已经发现和定位了26000多个功能基因 。 耗时13年，30亿美金。 人类基因组计划（HGP） 1977年 2005年 Roche 454 2006年 Illumina GA 2007年 ABI solid 2008年 Helicos 单分子测序仪 2009年 Pacific 单分子测序仪 第一代 第二代 第三代 二代测序技术的出现 鸟枪法 基因组 基因组片段 鸟枪法 基因组片段 通过剪切力，超声，酶切等打断基因组 ATTGTTCCCACAGACCG CGGCGAAGCATTGTTCC ACCGTGTTTTCCGACCG TTTCCGACCGAAATGGC TTGTTCCCACAGACCGTG AGCTCGATGCCGGCGAAG ATGCCGGCGAAGCATTGT TAATGCGACCTCGATGCC ACAGACCGTGTTTCCCGA AAGCATTGTTCCCACAG TGTTTTCCGACCGAAAT CCGACCGAAATGGCTCC TGCCGGCGAAGCCTTGT 基本测序思路 ATTGTTCCCACAGACCG CGGCGAAGCATTGTTCC ACCGTGTTTT