TOLL样受体7部分片段克隆..docVIP

TOLL样受体7部分片段克隆 摘要：本研究从猪的血液中提取总RNA，利用RT-PCR技术，克隆了猪Toll受体7部分基因片段，并对其回收进行检测分析。该基因为900bp，编码299个氨基酸，由含胞外区、跨膜区和胞内区的I型跨膜蛋白受体组成。通过对其进行序列分析可知，克隆的基因片段与GenBank上登载的序列的同源性为99.6%。这为TLR7全基因及其所编码的蛋白质结构和功能的研究进一步奠定了基础。 关键词：RT-PCR技术、序列分析、克隆 Fragment Domain Cloning of Toll-like Receptor 9 Gene of swine JIA Tian-tian （Class 2 of Pharmaceutical preparations，Graduated in 2012） Abstract：In this study, total RNA were withdrawn from the lymphocyte separated from swine blood. Part of TLR7 genes were cloned by using RT-PCR technology and the recovery analysis were also detected. The sequence analysis results showed that total TLR-7 gene was 900 bp in length, encoding 299 amino acids, consisting of extracellular, transmembrane and intracellular domains. The sequence analysis showed that the homology of amino acid sequence by cloning and that from GenBank issue is 99.6%. This has laid the foundation for the further investigation of structure and function encoding by TLR7 gene. Key words：RT-PCR technology、sequence analysis、cloneToll样受体Toll-like receptors，TLRs是1997年发现的介导天然免疫和获得性免疫的病原模式识别受体，主要参与对微生物病原体相关分子模式的识别。TLRs家族成员识别仅表达在病原微生物上的高度保守的结构基序 (Motifs)—病原相关的分子模式 (Pathogen—associated molecular pattern，PAMP)。PAMPs包括各种细菌细胞壁成分酵母细胞壁上的甘露糖，鞭毛蛋白、细菌DNA和病毒的双链单链RNA等。TLRs通过对PAMP进行识别，引发信号传导导致炎症介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统。Toll样受体7于2000年才被发现，在ssRNA病毒的识别及病毒感染的信号传递中起重要作用。表达TLR7的细胞主要为免疫细胞，包括浆细胞样树突状细胞 (Plasmacytoid DC，pDC) 和巨噬细胞，此外，TLR7在嗜酸性粒细胞 (Eosinophils) 和中性粒细胞 (Neutrophils) 中也有一定水平的表达。 近10年来，人类TLRs的作用及其与疾病抗性间的研究取得了重大进展，而对动物特别是猪TLRs在宿主防御病原微生物中的作用研究较少，且不深入。本研究主要运用RT-PCR技术，对猪的PTLR-7的基因进行克隆，并对其DNA进行测序。本试验于2012年3月2日至2011年4月30日间在河南省动物性食品安全重点实验室进行。 在河南农业大学猪病门诊的病猪体内采集的血液。 基因工程菌DH5α、PMD18载体购自TaKaRa公司。 反转录引物（Oligo(dT)18prime）、RNA抑制酶（RNase biter）、反转录酶（Revert Aid）均购自Fermentas公司；BamHI、 Hind III、Ex Tap DNA 聚合酶 、10x Buffer、DL2000DNA Marker、 DL5000DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖购自Promega公司。三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、酚、酚：氯仿：异戊醇均购自上海生物工程有限公司；淋巴细胞分离液有索莱宝科技有限公司生产；DNA凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；质粒DNA小量制备试剂盒（离心柱型）