RT-PCR操作流程及其相关注意事项.docVIP

RT-PCR 一知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 2、PCR技术(Polymerase chain reaction)： 即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； 2、RNase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 4、引物的设计及其原则： 引物的特异性决定PCR反应特异性。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。 b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。 c、 3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。 d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。 f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。 g、5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。 RNA提取（用Trizol法提取） RNA提取的一般步骤是：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA DEPC-treated water：100ul DEPC +100 ml ddH2O制成1‰DEPC水，放入RNase-free的玻璃瓶中用RNase-free的玻璃棒搅拌，静置12小时以上，高温高压消毒。 RNase-free H2O的制备：把水加入到RNase-free的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01%（v/v）含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶 RNA沉淀 ↓ 水相转移至一个新的1.5mlEP管【注意：EP管垂直；枪垂直、贴壁、用200ul枪缓慢抽；一共最多抽400ul，宁缺勿滥】 ↓ 混合冷的异丙醇 (或冷的乙醇：因DNA、RNA都溶于水而不溶于乙醇或异丙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA 。乙醇能够消除RNA的水化层从而使RNA从水中沉淀下来RNAse free water（经DEPC 处理的水）（逆转录试剂盒里的一般用不完） 20ul吹打几次，溶解RNA ↓ 用紫外分光光度计测定A260/A280及RNA的浓度1.8~2.0比较好（或电泳） 注： 1、紫外分光光度计的使用： 打开后面的电源→按RNA→确定RNA对应的设置时1OD=40 →向比色皿中加入50ul高温消毒之后的三蒸水→blank→将其中的水吸出→加入3ulRNA+47ul三蒸水漩涡混匀后的样品→dilution→enter→sample（默认光程为10mm，比色皿光面对着自己） 2、融解RNA一般使用TE Buffer保存RNA应该尽量低温GeneCopoeiaTM First Strand cDNA Synthesis Kit） ：1、准备：缓慢颠倒混匀试剂，避免起泡，并经瞬时离心后，放置冰上待用。 用于制备RNA-Primer Mix的EP管需在冰上预冷。 制备RNA-Primer Mix（RNA--引物混合），轻弹几下混匀，瞬时离心 3、变性RNA ↓ 65℃加热RNA-