5分子生物学方法(上)概述.ppt

？现代分子生物学的快速发展 分子生物学研究方法，特别是基因操作技术和基因工程技术的进步。 核酸操作技术主要包括：核酸凝胶电泳、核酸的提取与纯化、 PCR扩增、突变位点的检测、 DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析、核酸分子杂交以及基因的人工合成、定点突变等。 一、核酸分离原则 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要过高； 控制一定的pH值范围(pH值5-9); 保持一定的离子强度; 减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。 一、核酸分离原则 （二）防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 1 DNA酶抑制剂 金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，使用其螯合剂可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2； 阴离子型表面活性剂：如SDS对核酸酶有抑制作用，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物高盐溶液中沉淀。 一、核酸分离原则 （二）防止核酸的生物降解 2、RNA酶（RNAase) RNAase分布广泛，极易污染样品，且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作