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质粒提取和酶切分析 中心实验室 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 碱裂解法小量制备质粒DNA 一．实验目的及背景 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。 质粒图谱的阅读 复制起始位点Ori? 即控制复制起始的位点。 原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 ?抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+? ，Neo 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段? P/E 启动子/增强子 Terms? 终止信号 加poly（A）信号? 可以起到稳定mRNA作用 质粒图谱的阅读 质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上. 质粒特点 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。 质粒类型 质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 严紧型质粒 松弛型质粒 1. 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。 2.严紧型质粒 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。 其他分类： 克隆质粒 和 表达质粒 原核质粒、真核质粒、穿梭质粒 表达质粒就是指带有启动子，增强子等等，使其在宿主体内不仅仅是可以复制，还能够通过转录翻印，在宿主内表达出相应蛋白的质粒 穿梭质粒是指可以在多种宿主下复制。比如说通常能够在哺乳动物，酵母或者其他细菌复制表达的质粒，同时可以在大肠杆菌内复制。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。 质粒的应用 大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 分离质粒DNA方法 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱裂解法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 碱裂解法基本原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 实验试剂 1．菌种 含质粒DNA的大肠杆菌工程菌DH5α 2．LB液体培养基 3．10mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液 4．含Amp的LB固体培养基 5．Tris-HCl饱和酚(pH8.0) 6．溶液Ⅰ 含50mmol/L葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na2，25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)。（8磅高压） 7．溶液Ⅱ 含200mmol/L NaOH，10g/L SDS，临用前用两种溶液的贮存液配制。 8．溶液Ⅲ 5mol/L醋酸钾溶液60ml(称取29.4g醋酸钾定容至60ml)，冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml混合而成。 9．10mg/ml RNase A 10．TE缓冲液(pH8.0) 11．其他试剂 氯仿、无水乙醇。 三．实验方法 1．用接种环挑取1环冷冻保存的含质粒DNA大肠杆菌工程菌，划线接种于含有Amp的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养约12h(过夜)。 2．用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有5 ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)的试管中，37℃摇荡培养过夜。 3．取1ml菌液加入1.5ml的EP管中，12 0