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乳酸菌启动子探针载体的构建及功能验证 汇报内容 一、研究背景及立题依据 二、实验方案 三、实验结果与分析 四、结论 一. 研究背景及立题依据 （1）乳酸菌基因工程菌株在食品、医药、饲料等工业中都有着重要的应用。 （2）高效稳定的表达载体是乳酸菌工程菌株获得的基础。 （3) 启动子是决定外源基因表达效率的关键遗传元件。 乳酸菌启动子获得方法？ 已知基因推测 人工合成启动子库 鸟枪法构建基因组文库 乳酸菌启动子探针载体 启动子探针载体:携带报告基因、抗性标记和转录终止子，但无启动子的克隆载体 构建启动子探针载体的关键 名称 报告基因 复制子 抗生素标记基因 大小 构建年份 pGKV210 cat-86 pWV01 Emr 8.7kb 1985 pGKV110 cat-86 pWV01 Emr 8.7kb 1985 pBV5030 cat-86 pWV01 Emr 约4.6kb 1991 pKTH1750 cat pSH71 Emr/Tcr 6.7kb 1991 pNZ272 gusA pSH71 cat 4.7kb 1994 pAK80 LacL和LacM p15A Emr 11kb 1995 pNZ7120 alr pGH71 Emr 6.2kb 2004 pWL1 luc pWV01 Emr 5.3kb 2006 pMDY23 gusA pNC293 Sp 6.1kb 2006 已发表的乳酸菌启动子探针载体 合适的报告基因： 方便启动子筛选和分析 使菌体显蓝色：易筛选 底物多种且水溶：易分析，方法多样 乳酸菌本身不表达：活性检测无背景干扰 gusA（β-葡萄糖醛酸酶基因） 宽宿主的复制子：pWV01 pWV01复制子 乳杆菌 乳球菌 大肠杆菌 二、实验方案 报告基因gusA的克隆及含gusA的重组质粒pMG36eGUS构建 利用平滑化技术构建启动子探针载体pMGPP 启动子探针载体在大肠杆菌中功能验证 启动子探针载体在植物乳杆菌中功能验证 （一）gusA的克隆及重组质粒构建  植物表达载体 pBI121 报告基因gusA的来源： 基础质粒的选择： 穿梭质粒pMG36e 三、实验结果与分析 重组质粒pMG36eGUS的酶切鉴定 gusA M 1 2 3 2.5kb 1.0kb 5.0 kb pMG36e （二）利用平滑化技术构建启动子探针载体 删除融合型启动子P32 双酶切： 平滑化： 粘性末端变成顿端 测序分析P32删除情况 P32 （三）pMGPP在大肠杆菌中功能验证 组成型，高活性，验证功能 slpA（S层蛋白基因启动子）： pMGPP中插入了slpA，验证其功能 pMGGS： 1 2 3 空 KW1 携带pMGPP的KW1 携带pMGGS的KW1 大肠杆菌KW1菌体GUS染色 （四）pMGPP在植物乳杆菌中功能验证 植物乳杆菌WQ0815菌体GUS染色 1 2 3 空WQ0815 携带pMGPP的WQ0815 携带pMGGS的WQ0815 四、结 论 启动子探针载体pMGPP构建成功 pMGPP在大肠杆菌和乳酸菌中具有启动子探针载体的功能 谢 谢 2010年 6月12日 * 乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌通称，广泛应用于食品、医药和饲料工业，尤其发酵乳制品生产（凌代文和东秀珠，1999）。随着基因工程技术的发展，改良乳酸菌发酵性能和益生性能工程菌株的构建已取得了可喜进展（An et al ., 2010）。高效稳定的表达载体是乳酸菌工程菌株获得的基础，而启动子是决定外源基因表达效率的关键遗传元件。因此，为了构建具有自主知识产权的高效乳酸菌表达系统，广谱高效乳酸菌启动子的获得尤为重要 (de Vos et al., 1999)。 * 乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌通称，广泛应用于食品、医药和饲料工业，尤其发酵乳制品生产（凌代文和东秀珠，1999）。随着基因工程技术的发展，改良乳酸菌发酵性能和益生性能工程菌株的构建已取得了可喜进展（An et al ., 2010）。高效稳定的表达载体是乳酸菌工程菌株获得的基础，而启动子是决定外源基因表达效率的关键遗传元件。因此，为了构建具