纤维素柱对超氧化物歧化酶的提取.doc

纤维素柱的制备及其在超氧化歧化酶提纯中的应用 (武汉大学 化学与分子科学学院,武汉 430072) 摘要:本实验以纤维素为原料,经铜氨溶液处理后制得生物高分子量的分级、尺寸排除色谱柱的纤维素柱填料，并以此填料作为柱填料，提纯离心的从猪血中提取的超氧化物歧化酶（SOD）并以紫外吸收法检验其在280 nm处的吸光度，绘制淋洗曲线，以邻苯三酚自氧化法检验SOD的酶活性，并评价纤维素柱对超氧化物歧化酶的提纯能力。 关键词：超氧化物歧化酶（SOD） 纤维素柱生物高分子填料　　尺寸排除色谱 紫外吸收法 淋洗曲线 　邻苯三酚自氧化 中图分类号O 643 文献标识码A 0引言 超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于生物体中，按照其所含有的金属离子的不同分为：铜锌超氧化物歧化酶（Cu·Zn- SOD），锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)，铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。其催化反应如下： 2O2 -+2H+→H2O2+O2 在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能专一的清除O2-，保护细胞，能治疗多种疾病，并能抗衰老，对生物体有保护作用。 在猪血液中，Cu·Zn- SOD 与血红蛋白等共存于红血球中。当红血球破裂后，用氯仿-乙醇处理溶血液，使血红蛋白沉淀，Cu·Zn- SOD 则留在水-乙醇溶液中。将磷酸氢二钾加入水-乙醇溶液中时，由于其极易溶于水中，而在乙醇中的溶解度很小，溶液明显分层，上层是具有Cu·Zn- SOD 的含水乙醇相，下层是磷酸氢二钾的水相。分液后向上层含Cu·Zn- SOD 的水-乙醇相中加入丙酮使SOD 沉淀。极性有机溶剂能使蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝聚而沉淀。将所得的蛋白质在PH=7.6 磷酸缓冲溶液中，用尺寸排斥色谱柱进行纯化。 本实验采用邻苯三酚((HO)3C6H3,1,2,3-benzenetriol)自氧化法测定超氧化物歧化酶的活性[6-9]。邻苯三酚自氧化的机理极为复杂，其在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后，反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30-45秒后，与时间成线形关系，一般线性时间维持在4min的范围内。中间物在317nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于其能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2,阻止了中间物的积累，通过计算就可求出SOD的酶活性。邻苯三酚自氧化速率受pH、浓度和温度的影响，其中pH影响尤其显著，因此测定时要求严格控制pH值。 高分子与低分子化合物之间最明显的一个特征是其性质与分子量密切相关，对生物高分子的研究需要对生物高分子进行分级。传统的有机沉淀剂会使得生物大分子变性失活，尺寸排除色谱因可避免上述问题而得到广泛的应用。尺寸排斥色谱的基本原理是基于高分子的分子量不同而得到分离的。当高分子流过孔径具有一定尺寸分布的色谱柱填料时，分子量小的高分子由于尺寸小进入空隙的几率较大，运动的路径较长，其保留时间较长，较晚流出色谱柱，从而达到分离的目的。利用纤维素作为填料柱，具有强度高，尺寸稳定性好，分辨率高，成本低等特点，并以PEG—2000与纤维素铜氨溶液共混合克服孔径太窄，分级范围很窄的缺点。本实验便是以这种填料来提纯超氧化物歧化酶，检验其性能。 １实验部分 1.1试剂与仪器 试剂：CuSO4.5H2O, 20%NaOH, PEG—2000, 棉短绒，4%硫酸，异丙醇，浓氨水，95%乙醇，氯仿，K2HPO4.3H2O ,K2HPO4, 0.9%NaCl, 丙酮，10m mol/L HCl, 邻苯三酚（用10m mol/L HCl 作溶剂配制，4℃下保存），新鲜猪血500mL，2.5%草酸钾，甲醛溶液，三羟甲基氨基甲烷（Tris-） 仪器：烧杯（250mL、500mL、50mL各2个，800mL一个），量筒（50mL、100mL）,1000mL分液漏斗（1个），药匙，洗瓶，抽滤装置（抽滤瓶、布氏漏斗各2个），玻璃搅拌棒，，自动部分收集器（1），电磁搅拌器（1），玻璃色谱柱（1.5×20cm），试管２０支（5ml），台秤，抽滤水泵（1），注射器及针头（若干），冰箱（１），离心机（２）紫外分光光度计（UV） １.２实验步骤 ①Cu(OH)2的制备 取50ｇCuSO4.5H2O，加200ｍLH2O搅拌加热至沸，缓缓加入12mL 25-28 0/0的浓氨水，并搅拌。冷却至室温后，用水将沉淀洗至中性。抽滤洗涤后，加170mL H2O于沉淀中，冰水浴条件下加入80mL 20%NaOH溶液，再用水洗至中性，抽滤得天蓝色湿Cu(OH)2（含水率约60 0/0）。 取８ｇ