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2013年分子生物学实验技术实验报告实验名称：口蹄疫病毒VP1蛋白的表达姓名：学号：班级成绩一、实验目的本实验从口蹄疫病毒核酸的提取、分离、纯化、鉴定等实验技术入手，通过DNA技术、RNA技术和蛋白技术实验技术的应用，训练学生掌握分子生物学的基本试验方法和操作技能，进一步巩固理解分子生物学的基础知识和相关理论，从而为毕业论文选题和开展分子生物学方面的研究项目奠定基础。二、实验材料与器材1、病毒样品：口蹄疫病毒强毒株和阳性口蹄疫冰帝VP1重组质粒2、仪器设备：凝胶图像分析系统、PCR仪、恒温水浴锅、培养箱、高速台式离心机、超低温冰箱、漩涡混合器、微量移液器等3、试剂：pMD -18载体、PCR胶回收试剂盒，反转录试剂盒等4、溶液：LB液体培养基，电泳缓冲液，0.1mol/l Cacl2溶液，氨苄青霉素母液，10％SDS，10％过硫酸铵，1.5M Tris-HCL，1M Tris-HCL，考马斯亮蓝染色液，脱色液，电转缓冲液，包被液，显色液等三、实验方法（一）反转录聚合酶链反应（RT-PCR）1、口蹄疫病毒总RNA的提取1.1将250μL液体口蹄疫病毒样品加入1.5mL离心管中，再加入750μL预冷的冰RNAiso Reagent。1.2 将样品剧烈混合后，在室温静置5分钟。1.3加入200μL氯仿，颠倒离心管混合两次，并剧烈震荡混匀，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5分钟。1.4在4℃ 条件下，以12000×g 离心15分钟。1.5将上层水相转移到一个新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少10分钟。1.6在4℃ 条件下，以12000×g离心15分钟后，小心并尽可能地除去全部上清液。1.7用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁，4℃ 12000×g 离心5分钟后小心弃去乙醇。1.8将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μL无RNase污染的水（RNase-Free water）将RNA溶解并于-20℃保存备用。（二）反转录1、反应体系（10μl）如下：组份体积5×Buffer2μLdNTPs3μLRNA酶抑制剂0.5μL下游引物0.5μL反转录酶AMV0.5μL提取的RNA3.5μL总体积10μL2、加完后的体系，轻弹混匀，瞬离。3、反应条件：42℃，1小时。4、完成以后进行下一步实验或者放-20℃保存备用。（三）聚合酶链反应（PCR）1、反应体系（25μl）：组份体积ddH2O16.25μL10×PCR Buffer2.5μLdNTPs2μLP11μLP21μLTaq酶0.25μLcDNA template2μLTotle25μL2、设立阳性对照组和阴性对照组。3、加完体系后，轻弹混匀，瞬离，上PCR仪。4、特异性反应条件为：预变性 94℃ 5min变性 94℃ 1min退火 55℃ 1min 30 Cycles延伸 72℃ 1min终延伸 72℃ 10min（四）PCR产物检测：琼脂糖凝胶电泳1、电泳缓冲液TBE（10×）的配制：称取Tris-base 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(PH 8.0) 20 mL，定容至1000mL。2、1.0%琼脂糖凝胶的配制：称取1.0g琼脂糖于三角锥形瓶中，加入10mL 10×TBE缓冲液，并加水定容至100mL,加热溶解后加入5μL EB（10mg/mL），摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。3、电泳检测：取PCR产物5μL于Loading Buffer 1μL混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入5μL DL2000 DNA Marker 作对照，以100V电压，50mA电流进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。基因克隆（一）DNA片段与载体的连接反应体系（10μL）：组份体积Ligation SolutionI5μLPCR回收产物4.5μLpMD18-T0.5μL总体积10μL 2、反应条件：16℃，4小时以上。（二）感受态细胞的制备试剂的配制：1、LB液体培养基：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，氯化钠10g，溶解于800mL去离子水中，用氢氧化钠调PH至7.5，加去离子水定容至1L，高温高压灭菌20min。2、0.1mol/L 氯化钙溶液：称取1.11gCaCl2（无水，分析纯），溶于超纯水中，定容至100mL,高温高压灭菌或0.22μm滤膜过滤除菌。3、无菌甘油：取甘油100mL，高温高压即可。操作步骤（无菌操作）：从生长有大肠杆菌DH5α的平板上挑取一个单菌落，接种