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发酵工程实验指导书 （2014版） 宁波大学海洋学院 2014.09 目 录 实验一 乳酸菌的分离与初步筛选实验 实验二 乳酸菌的初步鉴定实验 实验三 乳酸菌菌种保藏实验 实验四 乳酸菌的培养与发酵实验 实验五 乳酸菌发酵产物的分析与测定 实验六 发酵罐操作训练 实验一 乳酸菌的分离与初步筛选实验 实验目的及要求 掌握从环境样品中分离所需微生物的一般操作 掌握平板划线分离菌种的原理和操作方法 掌握利用透明圈法获得单菌落菌株的原理。 实验原理 自然样品中存在混杂的微生物，通过选择性培养基及样品稀释使形成细胞分散液，再通过固体培养基在合适的培养条件下培养形成单菌落，由此得到分离的纯培养菌株。乳酸菌最基本的代谢特性是发酵产酸，待分离样品在合适的培养基和培养条件下，乳酸菌在特定设计的培养基中由于生长产酸产生溶钙形象，从而在培养基中产生透明圈，透明圈直径大小可反映菌落生长产酸量的大小，而不是乳酸菌或不产生酸积累的细菌不能产生透明圈。 实验器材 待用分离样品（腌菜，各种泡菜，酸奶，植物汁液，等）； 培养基：MRS培养基或改良乳酸菌分离培养基；无菌水； 器皿与设备：培养皿、移液管、试管、三角瓶、接种环、涂布棒、超净工作台、天平、采样瓶，培养箱，等。 方法和步骤 分离样品的采集 采样须知：结合乳酸菌菌种特性（文献资料查阅），获取乳酸菌在自然界或相关产品等的分布规律，设计样品采集范围。 采集样品经适当保存或立即处理。 菌种的分离 称取样品5g或5ml (加到45ml无菌水的三角瓶中（30℃恒温处理20分为佳）(充分震荡后（含玻璃珠）使其自然沉淀(用1ml移液管吸取上清菌悬液1ml至9ml无菌水试管中(依次进行10倍稀释至10-4~10-5(用移液管吸取1mL菌悬液至含碳酸钙的MRS培养基平板中，涂布均匀(30℃恒温培养2~3天(观察菌落，分别挑取生长良好的含透明圈的可疑乳酸菌单菌落，分别移接至普通乳酸菌培养基的斜面试管，菌种编号，30℃恒温培养1~2天，长菌后在4℃冰箱保存待用。 实验结果 在培养平板中观察各菌落生长情况，仔细观察可疑乳酸菌的菌落形态，大小，色泽，透明圈等特征，运用所学微生物知识初步确定其属于哪个菌属。 记录，选取，并标记，斜面移接和培养，待用。 思考题 阅读文献资料后设计你的采样方案并说明理由？目的是最大可能筛选分离得到乳酸菌。 产酸性微生物分离筛选的一般步骤？ 写作实验报告 附培养基配方及制备方法 含碳酸钙的MRS培养基（分离实验），除去碳酸钙即得斜面培养基。 配方如下：蛋白胨 10g，牛肉膏 10g葡萄糖 20g，酵母膏 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4.7H2O0.58g， MnSO4.4H2O0.25g，5g，吐-80 1mL，CaCO3 20~30g琼脂 15g，蒸馏水 1000mLpH6.8。（液体培养基则不加琼脂）配制方法：将各成分溶解，冷却至50℃，以醋酸调节pH为6.8，分装三角瓶，按量加入1.5%琼脂，121℃灭菌20min，备用。CaCO3灭菌成分同MRS培养基配方CaCO3）。 简单染色美蓝、结晶紫、碱性复红等。革兰氏染色法涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检革兰氏染色法涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。实验三 乳酸菌菌种保藏实验 一、 实验目的 了解菌种保藏基本原理与掌握菌种保藏方法 二、 实验原理 对实验二得到的经初步判定为乳酸菌的纯培养物进行菌种保藏。 菌种保藏原理：在低温、缺氧环境等条件下，抑制微生物的生命活动但不致死，使微生物长期保存生命活力且不死亡。 保藏法 原理 适宜菌种 保藏时间 操作要点 优点 缺点 斜面保藏法 低温 各种微生物 3-6个月 4oC 操作简便 易污染、易变异 穿刺保藏法（矿物油） 缺氧 好氧微生物 6个月-10年 覆盖无菌液体矿物油 操作简便 征对特殊微生物 干燥载体保藏法 干燥、寡营养、低温 产孢子真菌或形成芽孢的细菌 1-10年 沙土等过筛灭菌干燥，4oC 经济实用 征对特殊微生物 低温保藏法 低温 各种微生物 1-5年 -20oC，-80oC，加防冻保护剂 方便 运输较困难，不宜反复冻融 液氮保藏法 低温 各种微生物 2-9年 -196oC，加防冻保护剂，逐步冷却与解冻 保藏效果好，时间长 液氮蒸发 真空冷冻干燥保藏法 低温干燥 各种微生物 5-10年 真空冷冻干燥仪，加冻干保护剂 效果好，时间长，运输方便 冻干会有损伤 悬液保藏法 寡营养 丝状真菌、酵母、肠道细菌 1年以上 悬浮于不含养分的灭菌溶液，10oC 操作简便 征对特殊微生物 三、 实验器材 甘油，冰箱，