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实验讲解 杨远航 文献综述 猕猴桃溃疡病是由丁香假单孢杆菌引起的一种毁灭性病害，能从植株皮孔、皮孔、水孔、伤口等处入侵，具有传播速度快，腐蚀性强，致病性强，耐低温等特点，一旦植株感染上，很难根除，危害严重，该病1985年在我国湖南省东山峰林场首次发现。 所用药物 46.1%氢氧化铜、20%叶枯唑和50%氯溴异氢脲酸 叶枯唑 陕西上格生物科学有限公司 叶枯唑（化学名为N,N‘-双(5-巯基-1,3,4-噻二唑)甲二胺）是一种新型的内吸类杀菌剂。叶枯唑对水稻叶枯病、水稻细菌性条斑病、柑橘溃疡病等细菌性病害都有防治效果。 叶枯唑的作用机制 是从施药部位渗入到植物体中并向其他部位移动，从而能抑制已经产生的感染。不受雨量，气候等环境的影响,并可以保护根部不受土壤病菌侵袭和阻止向茎叶部蔓延。 目前该药物对溃疡病的相关研究 1995年承河元等进行了叶枯唑光分解产物对猕猴桃溃疡病病菌抑菌效果的测定 结果表明光分解后的叶枯唑抑菌效果高于未经光分解的。 氯溴异氰尿酸 氯溴异氰尿酸（C3HO3N3ClBr）是一种对作物的细菌、真菌、病毒具有强烈的强烈的杀灭、内吸和保护双重功能的杀菌剂。该药剂对水稻白叶枯、对瓜类角斑病、对柑桔溃疡病等多种病害都有良好的防治效果。 作用机制 氯溴异氰尿酸的作用机制是喷施在作物表面的氯溴异氰尿酸能慢慢地释放次溴酸(HBrO)和次氯酸(HClO)，次溴酸的活性是次氯酸的四倍，有强烈的杀灭细菌、真菌的能力，通过内吸传导释放次溴酸后的母体形成三嗪二酮(DHT)和三嗪(ADHL)，具有强烈的杀病毒作用；另外，因起始原料富含钾盐及微量元素群，有促进作物营养生长等作用。因此具有杀灭内吸和保护双重作用。 该药对溃疡病的相关研究 龙友华等人研究了6种杀菌剂对猕猴桃溃疡病病菌的毒力和田间防效 结果表明6种杀菌剂（土霉素、硫酸链霉、叶枯唑、三氯异氰尿酸等）土霉素效果最好、其次是硫酸链霉素、三氯异氰尿酸，叶枯唑效果最差。 氢氧化铜 作用机制 氢氧化铜的杀菌作用主要靠铜离子，铜离子被萌发的孢子吸收，当达到一定浓度时，就可以杀死孢子细胞，从而起到杀菌作用，但此作用仅限于阻止孢子萌发，也即仅有保护作用。 目前多用做抑制剂。 目前暂时没查到该药对猕猴桃溃疡病防治的相关文献。 实验方案 菌落计数 纸片法 平板划线法 菌落计数 采用平板计数法进行计数 纸片法 原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在己接种测试菌的牛肉膏蛋白胨平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度 （MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小 。 操作：将供试药剂分别稀释为100 倍、200 倍和400 倍, 用直径为6 mm 的圆形滤纸片分别放入以上药液充分浸吸后, 置于已活化的猕猴桃溃疡病病原菌培养基上, 每皿放3 片纸碟, 每种浓度设3 个处理, 用无菌水作对照, 培养24 h 后观察抑菌圈大小。 平板划线法 原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。同时用作药敏试验。 操作 在含药培养基进行划线，观察菌落的生长情况，可以得出不同药物浓度梯度对菌落生长的影响。 思路流程图 近期实验 近期方案 菌落计数 采用纸片法对氢氧化铜、叶枯唑和氯溴异氰尿酸进行抑菌实验 菌落计数操作 采用平板菌落计数法GB 4789.2—2010 1.用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 2. 按 1操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 3.根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 4.及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 纸片法的操作 1.药物的配置 分别称取氢氧化铜、叶枯唑和氯溴异氰尿酸约0.1g，每种药物3份，共9份至于9各烧杯中，加入0.2mlCMF，每种药配成3各浓度梯度，分别加入10ml、20ml和40ml蒸馏水溶解，配置为溶液。 将自制6mm纸片放入