核酸浓度测定..doc

核酸的定量与纯度的测定 在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。 分光光度法 分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。紫外分光光度法 紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33μg / ml，RNA约为40μg/ml，寡核苷酸约为35μg/ml。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度： DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000 RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。 A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。 A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。 A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。 实验步骤 1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.mmo1/L的Tris缓冲液内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。 2、用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线，测定OD260和OD280，并计算比值：OD260/OD280，纯DNA的此比值约为1.8～2.0。纯RNA的此比值约为大于2.0。 3、根据每毫升1微克的纯DNA的OD260值=0.020，计算所得DNA的纯度；每毫升1微克的纯RNA的OD260值= 0.025，计算所得RNA的纯度。 注意事项 OD值范围应该在0.1～0.99之间，否则不符合上述线性关系。 A260/A280比值可提供DNA纯度的一个参考，但A260/A280 比值会受pH影响。如果未调pH，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在10 mM Tris ClpH 8.5中检测，此时纯净的DNA A260/A280比值应为1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照）。 常见问题分析 1、DNA浓度测定的OD260/OD280比值大于1.8，说明存在RNA，可重新用RNaseA处理，酚：氯仿：异戊醇（23：24：1）抽提；DNA浓度测定的OD260/OD280比值小于1.8，则说明有蛋白质等杂质存在，需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化（也可加入1/8体积的3M NaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。 RNA浓度测定OD260/OD280比值小于1.8时，说明溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显； OD260/OD280比值大于2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。 2、采用紫外检测法测核酸含量的优缺点：用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。 3、样品中含有核苷酸类杂质：假如样品中蛋白质、核苷酸类物质较多可以通过离子层析柱进一步提纯，再用紫外吸收法测定。 4、样品体系中其它物质对实验结果有干扰：蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。定糖定磷法 定糖定磷法是通过测定核酸中戊糖和无机磷含量实现对核酸含量的测定。该法无需特殊仪器，只需要将地衣酚、二苯胺及钼酸铵等与核酸样品反应，再通过分光光度计测定光吸收值即可定量核酸。但此法准确度差、灵敏度低、干扰物多、操作繁琐，在现今的研究中已较少采用。比如二苯胺法是利用脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合