流式细胞术的应用..docVIP

第三节　流式细胞术的应用 　　节概述 ? 　　流式细胞术以其快速、准确、灵敏度高等优点，广泛应用于生物细胞周期和动力学的分析、各种肿瘤性抗原、肿瘤性蛋白、致癌基因、检测凋亡、免疫学的理论研究和临床诊断。 　　知识点导航 　　一、流式细胞术在细胞生物学中的应用 　　流式细胞术最早被应用于生物学研究领域，就是生物细胞周期和动力学的分析。Gohode和Dittrich第一个用流式细胞术测量细胞核DNA含量，以了解细胞周期的变化来研究药物干扰细胞周期动力学。目前，流式细胞术在细胞生物学研究中应用最广泛的是生物细胞增殖周期的定量分析。流式细胞术为生物细胞增殖周期的研究带来了全新的分析手段。 　　1．DNA倍体研究的理论依据　在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，DNA参量随着细胞增殖周期各时相而发生变化(图17－6)。G0期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即静止期细胞，DNA含量是较为恒定的2C，G1期的细胞具有增殖活性，是参与细胞周期循环的一群细胞，G1期细胞的DNA含量与G0期细胞DNA含量相同，均为2倍体DNA含量，当细胞进入S期后(细胞合成期)， 图18-6 细胞增殖周期与DNA含量分布直方图 DNA含量逐渐增加，从2C变化到4C值，直到细胞DNA倍增结束进入G2期，最终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C值，即为恒定的4C细胞群。 　　　荧光染料(如PI)与细胞DNA能够特异性结合，它们有一定的量效关系：1 DNA含量与荧光染料的结合成正比；2 荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比；3荧光脉冲与DNA直方图的通道值成正比。因此，流式细胞术可根据细胞的DNA含量将细胞分为三部分：G0/G1、S期和G2/M期。G0/G1期和G2/M期细胞峰的DNA分布均成正态分布，S期可认为是一个加宽的正态分布。其中，G2/M期的DNA含量是G0/G1期的2倍，S期的DNA含量介于G0/G1期与G2/M期之间。 　　流式细胞仪配有分析细胞各时相相对细胞数的拟合软件，它可将其测定的DNA直方图进行拟合，计算出细胞周期各时相的百分比及DNA含量。 　　2．DNA指数　FCM 定量分析一个细胞群，用DNA指数(DNA index，DI)衡量细胞的变异情况，DI可用下式计算： 　　DI=样品G0(G1)期的均值／正常2倍体细胞G0(G1)期均值 　　从上式可知，正常2倍体细胞的DI=1，如果DI 1则说明该群细胞异常。因此，DI是FCM进行肿瘤早期诊断的主要指标。 　　3．DNA分析的意义 　　(1)通过DNA的倍体分析可鉴别良、恶性肿瘤：良性肿瘤或良性增生时不会出现非整倍体细胞(DI 1)，而恶性肿瘤则伴有相当数量的非整倍体出现。所以出现非整倍体细胞是恶性肿瘤诊断的有力证据。 　　(2)药物对细胞周期的影响：在抗肿瘤药物的研究中，对其作用机理的研究，一般要观察药物作用在细胞周期的哪个时相，运用流式细胞术可使这方面的工作变得方便、快速、客观。例如推测某种药物作用于细胞的DNA合成期，通过流式细胞仪的检测，发现G2/M期数量减少，则有力地支持了推测的正确性。 　　二、流式细胞术在肿瘤病理中的应用 　　近年来流式细胞术已引起了肿瘤研究工作者的极大关注，尤其是以细胞DNA含量的测定最受重视，而荧光探针的发展，为流式细胞术研究各种肿瘤性抗原、肿瘤性蛋白、致癌基因等开辟了新的途径，极大地提高了肿瘤学的研究水平，使得流式细胞术在肿瘤的鉴别、诊断、治疗和预后方面得到了广泛的应用。 　　以DNA非整倍体与癌前病变的流式细胞术检测为例说明这一技术的应用。 　　癌前病变是早期诊断恶性肿瘤的重要环节，一般认为，正常组织细胞发生癌变有一个从量变到质变的过程。癌前细胞处于量变过程中的转化阶段，细胞的增生程度与DNA含量的异常改变呈平行关系。有学者用流式细胞仪对食管、胃、结肠、宫颈、鼻炎、口腔黏膜、宫内膜等部位的癌前病变做了检测和研究分析，结果表明：1 DI在正常细胞中不超过1.05，而随着增生程度增高DI也增高；2在正常组织细胞中不会出现非整倍体细胞，S期和G2/M期的相对细胞数比例不高，当出现非整倍体后，一般DI会随非整倍体上升而上升。这对恶性肿瘤的诊断具有结论性意义。肿瘤细胞DNA的动态变化，可作为指导肿瘤的治疗、了解病情发展过程和判断预后的有力证据。 　　三、 流式细胞术在凋亡研究中的应用 　　细胞凋亡又称细胞凋谢或程序性细胞死亡，是有别于细胞坏死而受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是当今生物学领域研究的热门课题之一。流式细胞术检测凋亡的主要方法有：1用荧光染料对DNA降解进行测定，目前最常用的是碘化丙啶(PI)染色，进行细胞周期分析，观察是否有亚2倍体细胞出现(图17－7)。2用