[实验六β.docVIP

实验六 β－半乳糖苷酶的固定化及应用 实验类型：综合型 适用对象：生物工程 参考学时：16学时 实验分室：发酵工程 [实验目的] 通过本实验掌握酶的固定化的原理，学习酶固定化的方法及了解固定化酶在实际中的应用。 [实验要求] 要求学生掌握酶固定化方法中共价结合法及其活力测定的基本方法和原理，能独立操作每一个实验步骤，培养学生熟练的试验设备操作，认真记录实验数据，并通过数据处理，分析实验结果。 [实验原理] 固定化酶在使用过程中有许多的优点，在制备固定化酶时应用最多的方法是共价结合法。本实验用尼龙作为载体，对β－半乳糖苷酶进行固定化。尼龙的机械强度高，有一定的亲水性，对蛋白质有一定的稳定作用，并且可以用多种方法进行部分降解活化。 本实验以尼龙为载体的酶固定化原理： 由于尼龙在生产和运输等过程中，使尼龙表面污染有非聚合单体、催化剂以及污染物等，为了除去污染物要在使用前进行尼龙的清洗工作。另外用CaCl2甲醇溶液处理尼龙会有利于3-二甲氨基丙胺对尼龙的部分降解。此方法是利用酶分子的氨基进行偶联，如果酶活性中心存在氨基，一定加以保护，本实验不用另外对酶的氨基加以保护。 乳酸酶（β－－半乳糖苷酶EC3.2.1.23）的性能作用： 乳糖酶主要作用是通过特定条件下水解β－半乳糖苷键，将乳糖水解成α－D－葡萄糖和β－D－半乳糖是使乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。最适的pH由大肠杆菌制得者为7.0－7.5；由酵母菌制得者6.0－7.0；由酶菌制得者5.0左右。最适作用温度是37－500C。钾、铵离子的存在可提高酶的活性。钠、钙离子有轻微的抑制作用。重金属对酶有强烈的抑制作用。在正常使用浓度下，72h可使74％的乳糖水解。该酶必须保质在原密闭的容器中，放在阴凉的避光处，温度为2－40C，酶在此条件下仍具有活性。 有一定比例的婴儿及某些成人由于肠内缺乏正常的乳糖分解酶而导致喂食牛奶后的腹泻等乳糖不耐受现象，故欧洲不少国家将乳糖酶和溶菌酶（防腐）加入牛奶，以供人们饮用。本实验通过固定化技术把β－半乳糖苷酶变成水不溶酶，就进行连续的酶反应来除去乳糖，从而通过工业化生成来降低成本。 [仪器、材料和试剂] 仪器 1.恒温水浴（室温至800C） 2.分光光度计 3. 冰点测定仪（精确度0.0050C） 材料 尼龙66网（40－70目） 鲜牛奶 氢氧化纳 磷酸氢二纳 磷酸二氢纳 无水氯化钙 浓硫酸 丙酮 医用酒精 无水酒精 葡萄糖 3-二甲氨基丙胺 戊二醛（电镜级） 乳糖酶（食用工业级） 3’,5’-二硝基水杨酸 苯酚（重结晶酚） 亚硫酸氢钠 酒石酸钾钠 三氯乙酸 （三）试剂 1mol/LNaOH 1mol/LHCl 0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.0 12.5％戊二醛溶液：将25％的戊二醛50mL用0.1mol/L的磷酸缓冲液定容至100mL（溶液配制后放在40C冰箱内并在一周内使用） 氯化钙CaCl2溶液：将18.6g CaCl2 溶解在18.6mL的水中，然后用甲醇定容到100mL 3’,5’-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 甲液 溶解6.9g结晶酚于15.2mL10％NaOH中，并稀释到69mL，在此溶液中加入6.9g的亚硫酸氢钠。 乙液 称取255g酒石酸钾钠，加到300mL10％NaOH中，再加入880mL1% 3’,5’-二硝基水杨酸溶液 将甲液和乙液完全混合即得到黄色试剂，贮存在棕色试剂瓶中在室温下放置7－10d以后使用 7、0.1％葡萄糖标准液 准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在1050C干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100mL，冰箱保存备用。 8、0.1％乳酸糖溶液 称取500mg乳糖，用少量蒸馏水溶解后定容至500mL，冰箱保存备用 9、20％三氯乙酸 称取20g三氯乙酸，用蒸馏水溶解定容后，定容到100mL 【实验步骤】 酶固定化 将40目－70目的尼龙网裁成1.5cm×1.5cm的小片，用1mol/LNaOH浸洗10min 水洗至中性 用1mol/LHCl浸洗10min 水洗至中性 乙醇洗去水分 丙酮洗20min除去脂溶性杂质 乙醇除去丙酮 控干。用CaCl2（含18.6％CaCl2和18.6％水的甲醇溶液）500C水浴处理20min 彻底水洗 乙醇脱水 控干。将尼龙网浸入3－二甲氨基丙胺中700C浸泡活化12h 彻底水洗（这时可以看到有大量的白色沉淀出现） 用pH7.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液洗 用含12.5％戊二醛的pH7.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液60C浸泡处理1h pH7.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液洗 将1g