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流式细胞仪操作规程目录 1：淋巴细胞亚群测定 2：HLA-B27测定 3：CD55／CD59测定 4：血小板抗体测定 5：红细胞抗体测定 6：粒细胞抗体测定 7：白血病免疫分型测定 8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定 9：XL操作步骤 淋巴细胞亚群测定 (流式细胞仪) 医院检验科 操作规程文件号： 200 年 月 日起实施 第1版 (共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和／或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 淋巴细胞亚群测定 (CD系列) 方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) 原理： 双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4．溶血样本不能用。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特 成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃ 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8℃ 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟 4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER Q—PREP制备系统 开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。 （*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体） 5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样） 报告结果 报告百分数（和绝对值） 操作性能 精密度 批内五次重复CV2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子 参考值(百分数（绝对值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2