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成人脂肪来源干细胞定向诱导分化为软骨细胞的实验研究 作者：梁笃, 樊粤光, 王海彬 鲁峰【摘要】 【目的】诱导脂肪组织来源干细胞(ADSCs)定向分化为软骨细胞并进行鉴定，为软骨组织工程获取大量种子细胞做准备。【方法】对患者抽脂术的脂质部分进行分离培养及传代，采用四氮唑复合物(MTT)法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线，通过流式细胞仪将培养的细胞行干细胞鉴定，将第4代的ADSCs向软骨细胞定向诱导分化并行阿新蓝染色鉴定;免疫组化检测成软骨方向诱导后的ADSCsⅡ型胶原的表达。【结果】ADSCs体外增殖速度快，并且保持稳定的倍增率直至13～15代;流式细胞仪分析提示该细胞具有干细胞特性;通过定向分化技术，ADSCs可向软骨细胞分化，阿新蓝染色及Ⅱ型胶原表达均呈阳性，说明定向分化后的细胞具备正常软骨细胞的功能。【结论】成功诱导ADSCs向软骨细胞定向分化，为软骨组织工程提供了可靠的种子细胞。 【关键词】 脂肪组织来源干细胞;软骨细胞/病/lixue/理学;组织工程;细胞培养软骨细胞来源不足一直是制约软骨组织工程应用的重大难题，由于软骨细胞取材复杂，而且难以一次获得足够的细胞数量以满足组织工程的需要，因此探索软骨细胞的其他来源具有重要的意义。干细胞为具有多向分化潜力的细胞，对干细胞进行定向诱导可分化为软骨细胞。脂肪来源干细胞(ADSCs)具有一般干细胞的特点，而且比其他细胞有以下优势：(1)获取容易;(2)体外增殖速度快，且不必进行永生化就能获得足够的细胞用于移植;(3)ADSCs能够进行自体移植，无免疫排斥反应等[1-6]。脂肪干细胞所具有的修复、替代和再生能力为临床医学提供了一个/fazhan/发展新疗法的机会。本研究对成人ADSCs进行了定向诱导分化，现报道如下。　　1材料与方法　11组织来源脂肪组织来自于南方医科大学附属南方/Medicine/医院整形外科住院病人腹部及大腿脂肪抽脂术获得的脂质部分,供体无传染病及内分泌疾病,男女不限 ,抽取前均获得供体本人同意，并承诺只用于试验研究，平均脂肪抽吸物100 mL。　12主要试剂和仪器DMEM培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)均由美国Gibco 公司提供;Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、转化生长因子(TGF)、四氮唑复合物(MTT)、硫酸酚嗪甲酯(PMS)、 吲哚镁辛、胰岛素、二甲基亚砜(DMSO)、 地塞米松均由美国Sigma 公司提供;鼠抗人CD29、CD34、 CD44、CD106、CD133、HLADR 单克隆抗体均由美国Zymed公司提供;CO2 培养箱(德国SHELLAB公司);离心机(德国Heraus公司);倒置显微镜(日本Nikon公司);酶标仪(日本Rader公司); BH光学显微镜、显微照相系统(日本Olympus公司);SWCJ1F型超净工作台(苏州净化设备厂);802型离心机(上海手术器械厂);DHW600不锈钢电热恒温水浴箱(余姚长江温度仪表厂)。　13人脂肪组织来源干细胞(ADSCs)的分离和培养[7]取人吸脂术中吸出的脂质部分，于超净工作台内用PBS缓冲液清洗组织并切除肉眼可见的小血管。将组织充分剪碎，1 g/LⅠ型胶原酶 ，37℃消化 40 min， 等容积DMEM+10%FBS 中和酶活性， 200 μm 筛网过滤，1 300 r/min 离心 5 min，DMEM+10%FBS重悬后，细胞悬液用细胞记数板记数，按1×104~2×104接种于25 cm2培养瓶中，培养瓶中加入完全培养基, 置入37 ℃、体积分数为5% 的CO2孵箱中培养,48 h换液后每3~4 d换液1次。原代细胞培养7～10 d即可融合传代。　14细胞传代弃去原培养液，PBS洗涤1次，以去除血清，加入适量25 g/L胰蛋白酶+038 g/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(覆盖瓶底即可)进行消化，于室温下消化约1 min，在倒置显微镜下观察见胞质回缩、细胞间隙增大，立即吸出消化液，加入适量基础培养基终止消化，用吸管反复轻柔吹打，将细胞吹打下来，800 r/min离心5 min，以含体积分数10%胎牛血清，10 g/L青、链霉素原液的高糖DMEM培养基重悬沉积细胞，按1∶2的比例进行传代。当传代细胞生长接近单层汇合80%时，可继续传代。　15MTT 法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线[8]收集第3代ADSCs，接种于 96 孔板，每孔2×103个细胞，加完全培养基200 μL,设每组4个复孔。置37℃、体积分数为5% CO2孵箱培养8 d，每天取1组细胞，吸弃上清, 每孔加入50 μL MTT-PMS工作液 (1485 mmol/L MTT、5 mmol/L PMS,混合比例为200∶1),继续培养4 h。振荡5 min,以主波长450 nm,参比波长630