生化实验1-2012.6.19.pptVIP

生 物 化 学 实 验 一、实验课的目的 1、培养和锻炼科学的思维方法、实事求是的科学态度和严格的科学作风，提高分析、解决问题的能力。 2、通过实验加深对理论课程的理解，学习掌握基本的生物化学实验技能与实验方法，为今后的学习和研究打下一定基础。 3、培养爱护公物、爱护集体、团结互助的优良品德。 1、课前必须预习，写好预习报告。 2、了解实验的基本原理和主要步骤，做到心中有数。 3、上实验课必须穿实验服，带实验讲义。 4、不许大声喧哗，有问题及时请教老师。 5、器材、药品等严格按规定使用，严禁乱用乱放。 6、实验过程中因个人未能按着实验要求操作而导致器材的损坏，按规章制度进行赔偿。 7、遵守实验制度，爱护仪器，注意安全（如，水、电、 煤气、强酸、强碱等）。 二、实验要求 8、实验过程要正规操作，动手、动脑主动进行实验；掌握关键，力求得出准确结果；仔细观察，认真思考，及时做好记录；综合分析得出正确的实验结论。 9、因故不能按时上实验者应有请假手续。 10、实验结束后将相关器材要彻底清洗干净，放到指定位置。 11、废弃物严格按要求分类收集、处理。 12、值日生要按规定要求将实验室打扫干净，检查门窗、水、电、煤气等。 三、实验内容 实验一、核酸的比色定量分析——紫外分光光度法 实验二、蛋白质的比色定量分析—— 考马斯亮蓝法 实验四、血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳 实验五、用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用 实验七、 DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白 实验六、猪肝（小牛肠）碱性磷酸酶的提纯及比活力测定 实验三、3, 5 - 二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖 实验八、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 实验九、酶联免疫吸附试验 实验十、蛋白纯化系统AKTA Prime plus分离混合蛋白 实验预习：20分 实验操作：30分 实验报告：50分 四、实验成绩评定 实验一 核酸的比色定量分析 ——紫外分光光度法 掌握紫外分光光度计的基本原理和使用方法 掌握紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法 实验目的： 1．核酸包括哪些？ 2．分光光度计的基本原理？ 3. 紫外分光光度法测定核酸含量的原理？有何优点及缺点？ 4. 何时用石英比色皿？何时用玻璃比色皿？为什么？ 思考题： 实验原理： DNA或RNA分子在260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与DNA或RNA的浓度成正比。核酸分子的形状，双链和单链之间的转换，也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便。 地衣酚显色法（RNA） ：在三氯化铁及盐酸存在下，RNA与3,5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质，其最大光吸收值在670nm处。地衣酚反应特异性较差，戊糖均可与地衣酚反应，DNA及其他杂质也能给出类似颜色。 二苯胺显色法（DNA） ：DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。 仪器及耗材： 紫外分光光度计，石英比色皿，离心管。 试剂： 小牛胸腺DNA，蒸馏水。 （1）用蒸馏水，将待测样品稀释（本次实验不需稀释）。 （2）取2只石英比色杯，加蒸馏水至2/3，在260nm下调零。 （3）取出比色槽外侧的比色杯，去掉蒸馏水，加待测样品 DNA，在260nm、280nm及310nm处读取OD值。 （4）小心取出比色杯，用蒸馏水清洗，将水吸干，放入比色 杯盒内。 操作步骤: 蛋白质和核苷酸等也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小，纯RNA的260nm与280nm吸收的比值为=2.0；纯DNA的260nm与280nm吸收的比值=1.8。 当样品中含有蛋白质、苯酚等杂质，则OD260/OD280比值下降，应设法去除。 （5） 纯度分析： OD260/OD280 （6）计算浓度： 纯DNA或RNA浓度可用下列公式计算： [dSDNA]=50×(OD260-OD310)× 稀释倍数（?g /ml） [SSDNA]=33×(OD260-OD310)×稀释倍数（?g /ml） [SSRNA]=40×(OD260-OD310)× 稀释倍数（?g /ml） 注意事项： OD310值是背景，若盐浓度高， OD310值也高。 OD260/OD280 对DNA而言其值约为1.8，