色谱技术答案..docVIP

1若想建立某中药的醇提液的RPHPLC指纹图谱，是采用等度洗脱还是梯度洗脱？简述其分析条件的优化。 答：1系统梯度洗脱 由于中药的醇体液成分复杂，样品的K（容量因子）范围宽，不能用等度洗脱，梯度洗脱可以使不同K值的样品成分洗脱时随流动相的连续改变而趋于同一K值，谱峰尖锐而对称，分离度改善，缩短分离时间，降低最小检测量和提高分离精度，从而让所有成分均出峰 2．优化思路： 梯度期间，强溶剂的浓度B%增大，优化梯度条件起始B%，终止B%，梯度时间t和溶剂B的种类，因此在RPHPLC指纹图谱建立时，考虑流动相种类，流动梯度范围和梯度斜率三方面。 流动相种类的选择：RPHPLC中常用甲醇，乙腈，四氢呋喃等有机溶剂与水混合，流动相种类由样品分离难易程度决定。MeoH、CAN、THF洗脱强度逐渐增高，样品易分离时采用溶剂优化法选择流动相和水的最佳比例，调整K值，使其在1—20(tR:3—35min). 梯度范围：即起始和终止B%一般为5%--100%（tR：30min）若谱图前段空白可提高初始B%，末端空白需降低终止浓度，可节省时间缩小梯度范围使所有组分短时间从柱中洗脱出来 梯度斜率：根据初步分离的谱图，峰密集部位可降低斜率，减小强溶剂B%变化速度，峰疏散部分提高梯度斜率，时间短 2，根据Van deemter f方程在液相色谱中的表现形式，分析在HPLC中影响柱效的因素及实验条件的选择。 答：Van Deemter 方程在液相色谱中表现形式为: 影响柱效的因素： 涡流扩散项：为避免涡流扩散而引起的峰扩张，需用小而均匀颗粒填充颜色等等 纵向扩散项：HPLC中Dm仅有Gc的10-4—10-5倍，该项系忽略。 固定相传质阻力项：降低固定液膜厚度，加快组分在固定相中的扩散 流动相传质阻力项：组分分子随流动相进入色谱柱时，靠近固定相颗粒的部分分子流速较慢，中央分子流速较快，而引起峰扩张，要降低该项需减小dp和u，增大Dm. 流动相滞留传质项：固定相的多孔性使部分流动相滞留于固定相某一局部，流动相中组分分子必须自流动相扩散到滞留区，才能与固定相进行质量交换，为降低该项，应采用颗粒小，微孔浅，孔径大的固定相。 （2）选择实验条件以提高柱效： 减小填料孔穴深度，减小填料粒度；用低粒度溶剂做流动剂，流动相采用低流速；适当提高柱温。 3、分析影响分离度的因素及提高分离度的措施 答：分离度是衡量分离效果的指标，基本分离方程： 分离度受动力学和热力学因素两方面的影响，因素有：效率因子n，选择性因子α，容量因子k’。 n：当固定相确定后，要使分离达到某一分离度，柱必须有最低限度的理论搭班数，增加柱长，减小柱H均可提高分离度。 α越大，柱选择性越好，α微变是R有较大变化，α∝1时，更为显著。Α的增加对提高分离度最有效，可通过改变固定相、流动相、柱温、样品结构一衍生化，使α变大提高分离度。 k’：R正比于 ，在填充柱GC中，R较大，k’对R影响可忽略。在液相色谱中，由于固定相对于流动相体积而言很小，溶质在固定相种的量亦很小，当k’增大时，R也迅速增加，k’可通过控制溶剂极性大小来调节。 2、提高分离度的措施： 1）改变流动相的组成：增加α。 2）改变流动相的PH：限用于样品为能电离的酸或碱。 3）改变固定相：因需换色谱柱、流动相，使k’、α在合适范围内不方便。 4）改变分离温度：升高温度，k’值减小，可减小溶剂洗脱能力来抵消此效应。 5）采用各种配位反应：提高分离的选择性。 4 影响薄层展开的因素有那些类型？如何影响的？ 相对湿度 展开时，最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性，随溶质、溶剂极性的增加，相对湿度范围也增大。 因为展开室中展开剂蒸气分子有取代吸附在薄层上的水分子的趋势，取代量决定于展开剂蒸气的极性和量；展开剂蒸气分子极性越大，越易取代吸附的水分子，使原吸附的水分下降，使薄层上吸附的水蒸气的影响越小。 ２．溶剂蒸气的影响① 展开室饱和有以下情况A ．展开室饱和：展开剂蒸气在展开室中达到平衡B ．预吸附：薄层板干燥板面对展开室气体分子的吸附C ．吸附饱和：薄层板干燥板面与展开室饱和气体空间达到平衡D ．毛细管饱和：薄层板所有的自由空隙借毛细管作用被溶剂充满的过程，即相当于展开后薄层的状态 ②“边缘效应”薄层边缘处低极性溶剂挥发快，因此边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf值相应增大③“脱混”、“双前沿” 未饱和展开时，吸附剂对多元展开剂的亲和力不同，∴展开剂的上升速度不同（亲和力ABC，则Rf值ABC）产生脱混；当展开剂极性差异较大时，由于吸附剂对不同极性溶剂产生不同的吸附作用，形成展开剂组分的浓度梯度，溶剂完全分离，产生“双前沿”现象。 温度的影响温