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2017-01-08 发布于北京
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[酶切鉴定

　　　限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。其特异性地结合于一段特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘性末端的DNA。在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：思考题 1、影响限制性酶切的因素有哪些？ 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 3、如何设置酶切反应的对照？ * 质粒DNA的酶切鉴定 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 实验原理 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 限制性内切酶切割DNA Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Construction of pGEM-xy1 Primer of PCR: PAP 5 GACCACGCGTATCGATGTCGAC mA5 5 GGCCAGGAGATTGAACTCAAG B: A: C: Mouse cells X-gene cDNA Ligation Ampr f1 ori pGEM-T Easy Vector(3015 bp) T T LacZ Apa I Sph I Nco I Not I EcoR I Spe I EcoR I Not I Pst I Sac I Ampr f1 ori pGEM- mA1-5R (3204 bp) LacZ Spe I EcoR I Not I Pst I Sac I 189 bp Apa I Sph I Nco I Not I EcoRI T7 pGEM-xy1 mA5 PAP 189 bp Strategy of construction D: Identify positive clone The product of PCR Sample M 189 bp Sample/EcoRI M 189 bp 3015 bp 3204 bp Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 反应物质粒DNA 10×Buffer RNase EcoR I ddH2O 总计体积（μl） 10 2 1 0.5 6.5 20 实验方案注意采用混合配样 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是电泳。凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，所以分离效率很高。核酸电泳 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. (一) 琼脂糖凝胶电泳以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素： 1. 核酸分子大小迁移率与分子量对数成反比。 2. 胶浓度: 迁移率与胶浓度成反比。 3. DNA 的构象: 一般条件下迁移率: 超螺